le développement Celest a été soutenu par le NIH accorde R21AG027513 et U01AG045864. Données et des représentations vidéo de courte durée sont adaptées de Restif et al. (2014) 8, qui ont été publiés sous la licence Creative Commons Paternité (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Nous remercions Ricardo Laranjeiro aide manuscrit.

1. nématode croissance et manipulation <ol><li> Cultivez C. elegans sur des boîtes de Pétri standard contenant NGM repéré avec OP50-1 Escherichia coli comme source de nourriture 1-3. </li><li> Maintenir les cultures dans un incubateur qui maintient la température désirée. C. elegans se développe bien entre 15 et 25 ° C, 20 ° C étant la température de croissance standard. NOTE: La natation est un phénotype robuste, mais nager vigueur peut être affectée par des facteurs environnementaux, y compris la contamination sur des plaques et la surchauffe des cultures et des diapositives. De fortes efforts pour maintenir des conditions stables doivent être faites. </li><li> Utilisez un pick nématode maison faite d&#39;un fil de platine flamme scellé dans une tige de verre pour gérer le transfert des animaux simples 4. </li></ol> 2. Mettre en place pour l&#39;analyse Swim <ol><li> Utilisez un système intégré constitué d&#39;un stéréomicroscope, caméra CCD numérique, et le logiciel d&#39;enregistrement vidéo numérique. Le logiciel Celest can être utilisé sur un ordinateur séparé. <ol><li> Couvrez le microscope avec un tissu sombre (par exemple, feutre) pour éviter l&#39; éblouissement dans la zone de chute de bain sur la lame de microscope et d&#39; améliorer la qualité de l&#39; image. </li><li> Réglez la distance et un grossissement de travail du microscope pour la vue de la zone de baignade, et le miroir de base pour obtenir net contraste des animaux contre l&#39;arrière-plan. Réglez l&#39;éclairage à fond noir pour visualiser les corps des adultes en blanc sur le fond noir, qui fonctionne très bien pour la visualisation de calcul et de suivi avec le logiciel d&#39;analyse de natation. </li><li> Prenez soin de garder la zone de travail, lame de microscope, et nager tomber très propre. Les débris peuvent interférer avec l&#39;analyse en bouchant la nage libre des adultes et minces fils de fibre peut être détectée comme ne bouge pas animaux pendant le suivi. </li></ol></li></ol> 3. Préparation des animaux pour l&#39;analyse de la condition physique en liquide <ol><li> Introduire à la pipette 60 ul otampon f 1x M9 dans un anneau de 10 mm préimprimé sur une lame de microscope. Assurez-vous que la goutte recouvre entièrement la zone à l&#39;intérieur de l&#39;anneau. Le logiciel extrait plus d&#39;informations de natation en utilisant cette taille de gouttes contenues sur une diapositive que ce serait si l&#39;utilisation des plaques multipuits. </li><li> Choisissez les nématodes adultes seuls et de les transférer dans la goutte de tampon 1x M9, ce qui minimise le transport de bactéries qui peuvent obscurcir le liquide. Minimiser les bactéries en plaçant d&#39;abord les animaux pour le transfert à un côté de la plaque qui ne contient pas beaucoup pelouse bactérienne, de les laisser ramper, et puis doucement les soulevant. <ol><li> Lors du transfert des nématodes dans la goutte, utiliser un champ de dissection à proximité de la station d&#39;analyse pour réduire la durée de bain, ce qui peut affecter le comportement des animaux 25. </li><li> Placez seulement 4 adultes dans la baisse si elles se déplacent vigoureusement et se croisent souvent. À titre indicatif pour minimiser chevauchement des nageurs (qui confond l&#39;analyse computationnelle), envisager de placer4 animaux par goutte quand ils sont aussi actifs que les jeunes, les adultes en bonne santé WT et 5 animaux par goutte quand ils sont plus âgés et montrent moins de vigueur. REMARQUE: les nématodes Healthy WT commencent instinctivement nager rapidement après avoir été placé dans un liquide. Avec l&#39;aide d&#39;un pic à nématode, séparer délicatement les adultes dans la goutte si elles agglutinent. </li></ol></li></ol> 4. Analyse de la condition physique en liquide - Enregistrement vidéo de la piscine <ol><li> Placez la lame chargée avec des adultes sur la base du microscope pour enregistrer leur piscine. Les détails de capturer des vidéos de 30 de comportement d&#39;un animal dans un liquide (vidéo 1), et l&#39; échantillonnage d&#39; un grand nombre de ces documents est facilement accompli quand aidé par un logiciel de Celest 8,26; cependant, nager plus longues périodes peuvent être idéal pour d&#39; autres études comportementales spécifiques 25. Surtout, assurez-vous de maintenir le même grossissement dans tous les enregistrements, car les différences de grossissement affect analyse de la natation et la comparaison volonté de polarisation. Remarque: Ces étapes sont fournies à titre indicatif en utilisant le logiciel d&#39;enregistrement numérique vidéo figurant dans le tableau des matériaux; logiciel d&#39;accès ouvert VirtualDub pourrait remplacer, même si nous avons pas testé. <ol><li> Utilisez les paramètres suivants comme guide pour l&#39;analyse de natation réussie: taille de l&#39;image de 696 x 520 pixels, la résolution d&#39;image de 0,02 mm / pixel, et un taux de 18 images / s. versions plus haute résolution de ces paramètres peuvent faciliter le suivi, mais ne seront pas affecter les mesures calculées par le programme. NOTE: La zone de baignade prévue par la chute de 60 pi de tampon 1x M9 sur la lame de microscope n&#39;a pas beaucoup de profondeur, ce qui réduit au minimum vers le haut et le mouvement de la natation vers le bas. </li></ol></li><li> Sous Paramètres, allez à &#39;Enregistrement&#39;, set &#39;Limit Sequence Taille »à« 545 cadres sur le disque ». Dans la même rubrique, cochez la case &#39;Use Recording Manager&#39;. Cliquez sur le &#39;enre actuelle Modifierle script ding ... &quot;bouton, et sous la rubrique« Commandes », sélectionnez« Grab Frame &#39;, et sous la rubrique «Conditions d&#39;arrêt&#39;, entrez &#39;Arrêt après 0: 00: 30.00. </li><li> Pour enregistrer, sélectionnez «Nouvelle séquence dans la RAM» sous la rubrique de la maison, puis appuyez sur le bouton «Record» rouge. Le logiciel va récupérer 545 cadres de plus de 30 s avec l&#39;appareil photo numérique et les tenir dans la mémoire RAM. </li></ol> 5. Analyse de la condition physique dans le liquide - Traitement vidéo <ol><li> Fragment de la vidéo dans une séquence de trames d&#39;image en cliquant sur l&#39;en-tête de la maison et en sélectionnant la séquence complète Exporter vers ... &quot;dans le logiciel d&#39;enregistrement vidéo. REMARQUE: Le logiciel d&#39;enregistrement vidéo numérique peut enregistrer les images que .bmp, .jpg, .tif ou .png, qui peut être lu par le programme d&#39;analyse de natation présenté ici. Notez que les fichiers .tif utilisent plus d&#39;espace de stockage, mais certains formats tels que .jpg peuvent dégrader la qualité de l&#39;image. </li><li> Lancez le programme d&#39;analyse de natation à partir de MATLAB by cliquant sur le bouton Exécuter. </li><li> Sur l&#39;écran d&#39;accueil du programme d&#39;analyse de natation, utilisez le &quot;Ajouter une vidéo&quot; ou &quot;Ajouter plusieurs vidéos de boutons pour télécharger des séquences d&#39;images cadres un à la fois ou en groupe tout en attachant des étiquettes pertinentes telles que le génotype, la date, le procès et la durée . Le logiciel crée une base de données des séquences marquées. </li><li> Activer le suivi simultané de plusieurs animaux dans les séquences téléchargées en cliquant sur &#39;1. Processus vidéos. Dans le nouvel écran, sélectionnez les vidéos souhaitées dans la case de gauche et cliquez sur «Ajouter à la liste &#39;. Pour chaque vidéo, cliquez sur son nom dans la liste en haut à droite pour afficher la première image de la vidéo en bas à droite. Délimiter la zone de baignade en sélectionnant 3 points à l&#39;intérieur de l&#39;anneau, et lancer le traitement en cliquant sur &quot;Process toutes les vidéos mentionnées ci-dessus. Voir les progrès du traitement au fond du centre. </li><li> Une fois terminé, &quot;Fermer&quot; l&#39;écran de traitement vidéo. </li></ol> 6. Analyse de la condition physique en liquide - Mesure <ol><li> Cliquez sur &#39;2. mesures Compute &#39;pour ouvrir un nouvel écran où les vidéos traitées peuvent être téléchargés, un à la fois, pour valider ou rejeter le suivi des animaux simples. Vidéos qui ont été traitées apparaîtront dans la liste à gauche où le nom de la vidéo peut être cliqué pour télécharger cette vidéo. </li><li> Utilisez cette étape manuelle de se concentrer sur les zones de suivi (blocs rouges) manqués par opposition à un suivi avec succès (blocs verts). NOTE: Alternativement, on peut compter sur la sortie automatisée de suivi valide puisque le logiciel dispose d&#39; un solide système de suivi (94,1% de validité observée en 2.020 animaux de 404 vidéos 8). <ol><li> Trouver la «Validité du corps segmenté» dans la première barre de couleur sur l&#39;écran dans la moitié inférieure. Le pourcentage des «cadres valides» est en vert, et le pourcentage des «cadres Rejeté» est en rouge. ≥80% des trames valides impliquent que le suivi information utilisé pour calculer des mesures vient d&#39;au moins 432 cadres sur 540 dans un 30 s nager essai enregistré à 18 images / s. </li><li> Facilement naviguer et modifier des blocs de validité / rejeté images utilisant le «bloc suivant», «Changer la validité», «bloc de Split &#39;, et les options« frame Isoler ». Dans les rares cas où 2 animaux croisent dans une zone de baignade peu fréquentée, changer leur numéro d&#39;identification sur une plage de trame spécifique avec le bouton «Switch». </li><li> Voir les graphiques à barres dans la moitié inférieure de l&#39;écran pour plus d&#39;informations sur le suivi et les performances qui se chevauchent. La longueur du corps segmenté (la longueur du corps de l&#39;animal par image) est en corrélation avec chevauchement des incidences. </li></ol></li><li> Si des points lumineux sur la vidéo interfèrent avec l&#39;analyse, ajuster les zones claires dans la zone de baignade en sélectionnant la fonction «zones Glare de. </li><li> Cliquez sur &#39;Enregistrer et mesures Calculer »pour enregistrer l&#39;entrée de validité avant jusqu&#39;àcharger une autre vidéo traitée. A ce stade , le logiciel calcule, en arrière - plan (non représenté à l&#39;utilisateur), des cartes courbure de la performance de nage des animaux individuels et les paramètres indiqués ci - dessous (vidéo 2). REMARQUE: Les paramètres mesurés qui sont axés sur ici sont décrits dans le tableau 1. Le taux d&#39;initiation Vague, nombre d&#39;onde du corps, l&#39;asymétrie, étirement, et le curling sont calculés sur la base des cartes de courbure que le logiciel calcule pour les animaux; la vitesse de Voyage, Coup de pinceau, et l&#39;activité des paramètres d&#39;index ne sont pas basées sur des cartes de courbure. </li><li> Cliquez sur «Fermer» pour quitter l&#39;écran des «mesures Compute de. </li></ol> 7. Analyse de la condition physique en liquide - Sortie des résultats Remarque: Le logiciel peut rendre compte de multiples mesures du mouvement de natation, qui couvrent de manifestes à très subtils traits comportementaux pas facilement marqués par oeil (Vidéos 3 et 4). Ici leaccent est mis sur 8 paramètres qui montrent généralement une bonne dynamique: taux d&#39;onde d&#39;initiation, le nombre d&#39;onde du corps, Asymétrie, stretch, de curling, de vitesse Voyage, Coup de pinceau, et l&#39;indice d&#39;activité. <ol><li> Sur l&#39;écran d&#39;accueil du programme, cliquez sur &quot;3. Résultats &#39;pour obtenir le résultat de l&#39;analyse. </li><li> Créer des groupes échantillons pour le traitement statistique en sélectionnant les séquences analysées souhaitées des images dans la zone gauche et en les déplaçant dans une nouvelle ou existante groupe d&#39;échantillons en cliquant sur les boutons &#39;Ajouter à l&#39;échantillon sélectionné »ou« Ajouter au nouvel échantillon ». </li><li> Cliquez sur &quot;Afficher les graphiques pour ces échantillons» pour aller à un second écran qui affiche les graphiques et les statistiques clés des échantillons pour chacun des 8 paramètres par sélection sur la partie supérieure de l&#39;écran. <ol><li> Si vous le souhaitez, d&#39;ajuster la représentation des graphiques à barres en haut à gauche de l&#39;écran en utilisant les «couleurs», «# d&#39;histogrammes &#39;et&#39; # de vers de les sélecteurs. </li></ol></li><li> Utilisation&#39;Histogrammes 2D »pour tracer des combinaisons de deux quelconques paramètres via la« mesure sur l&#39;axe X&#39; et &#39;Mesure sur l&#39;axe Y de la menus déroulants sur la gauche de l&#39;écran. Cliquez sur «Fermer» pour quitter et revenir à l&#39;écran &#39;affichage des résultats de. </li><li> Utilisez le bouton &#39;Exporter ...&#39; en haut à gauche de l&#39;écran pour enregistrer des données numériques détaillées .csv pour ouvrir et manipuler davantage dans un programme de feuille de calcul. </li><li> &#39;Fermer&#39; écran &#39;Résultats&#39; pour revenir à l&#39;écran d&#39;accueil et cliquez sur «Quitter» pour assurer l&#39;enregistrement de la base de données contenant les séquences vidéo analysées. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+connectome+of+a+decision-making+neural+network.">The connectome of a decision-making neural network.</a> Science. 337 (6093), 437-444 (2012).</li><li>Greenblum, A., Sznitman, R., Fua, P., Arratia, P. E., Sznitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+segmentation+using+texture-based+models+for+motility+phenotyping.">Caenorhabditis elegans segmentation using texture-based models for motility phenotyping.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 61 (8), 2278-2289 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;utilisation de C. elegans comme système modèle continue d&#39;augmenter en raison de sa malléabilité génétique, tractability expérimentale et de l&#39; anatomie annotée au détail méticuleux. Par exemple, la structure neuronale et la connectivité du C. elegans hermaphrodite est clairement cartographiés 34-36, ce qui facilite grandement les enquêtes sur les circuits neuronaux spécifiques qui contrôlent des comportements particuliers. 302 neurones constituent le système nerveux de l&#39;hermaphrodite adulte, qui traitent d&#39;un large éventail d&#39;entrées sensorielles en sorties comportementales de base comme la locomotion. La structure du système nerveux mâle plus complexe a également été décrite 37, circuit de validation spécifique du sexe à traiter. 37 C. elegans comportement a été largement étudié sur des plaques de culture standard contenant des milieux solides. Depuis WT C. elegans se déplace dans des ondes sinusoïdales prévisibles sur des plaques d&#39;agar-rempli, écarts par rapport auschéma global peut être détectée par l&#39;œil et a marqué manuellement. Cette approche, cependant, est soumis au critère de l&#39;expérimentateur et de main-d&#39;œuvre. Outils matériels et logiciels conçus pour suivre et mesurer C. elegans locomotion sur des milieux solides supprimer la polarisation de la subjectivité et de permettre des études à grande échelle, ce qui permet des questions biologiques plus sophistiqués à traiter. La base de données de comportement récent créé par le laboratoire Schafer 16 est un excellent exemple de l&#39;extension analytique et approfondie qui a été réalisé avec un système de calcul de locomotion sur des plaques. Lorsque WT C. elegans est placé dans un liquide, l&#39;animal adapte rapidement son mouvement au nouvel environnement, initiant une baignade. C. elegans piscine utilise une plus grande amplitude de mouvement que l&#39; exploration et peut être plus irrégulière 8. Des logiciels comme Celest est destiné à combler l&#39;écart pour une analyse détaillée de C. elegans comportement dans un liquide, permiPrép quantification des paramètres de mouvement associé qui ne sont pas faciles à mesurer par l&#39;œil non assistée, ou qui peut être accompli plus rapidement que la notation manuelle. Dans 8 h dure un individu pourrait traiter jusqu&#39;à 200 vidéos, ~ 1000 enregistrements par jour. Le logiciel définit la natation évaluer les paramètres qui servent une empreinte digitale complète de la condition physique et le comportement. En plus d&#39;enrichir la compréhension des aspects complexes de C. elegans comportement liquide et leurs voies moléculaires sous - jacents, ce logiciel peut être utilisé pour explorer de multiples aspects de la biologie , y compris les réponses pharmacologiques, le vieillissement et le comportement distinct. Présenté ici, la vue d&#39; ensemble des changements quantifiés qui se produisent dans la performance physique de C. elegans adultes comme ils l&#39; âge est un exemple d&#39; une telle application du logiciel (pour un compte rendu plus détaillé, voir Restif et al. 8). Dans le contexte du vieillissement, certains paramètres mesurés ont diminué tandis qued&#39;autres ont augmenté ou n&#39;a pas changé de manière cohérente dans le type sauvage. Les tendances ont été confirmées dans une large mesure par le profil de calcul des mutants de longévité, et les profils relatifs des cohortes de ager gracieuses et mauvaises des populations du même âge conservés dans des conditions environnementales uniformes. La haute résolution du logiciel peut également révéler des phénotypes subtiles jusque -là inconnue dans les mutants largement caractérisés (par exemple, l&#39; âge-1 (hx546) dans la figure 1). Il y a quelques étapes particulièrement critiques du protocole décrit. Le maintien d&#39;un environnement de température constante entre l&#39;environnement de bain et la culture de la plaque de déformation est importante pour nager reproductibilité, alors expérimentateurs sont fortement encouragés à aller à de grands efforts pour éviter les changements de température aléatoires. médias de natation doivent être à la même température que les plaques. De même, une attention particulière à la taille des gouttes pour la baignade contribuera à assurer la reproductibilité. Enfin, il est prudent de penser enavancer sur le déchargement des gros fichiers vidéo qui accumulent. Le traitement des images sur un site en dehors de l&#39;ordinateur de capture vidéo est recommandée. L&#39;utilisation du logiciel présenté ici pour l&#39;analyse de natation a certaines limites. Premièrement, bien que les programmes peuvent suivre simultanément plusieurs animaux, si plus de cinq animaux sont analysés conjointement, il y a un risque accru que les animaux vont nager à travers les uns des autres dans les images vidéo. Lorsque le programme ne peut pas clairement déterminer quel animal était qui, censure ces trames de données. Bien que cette fonctionnalité du programme garantit que les données pour les animaux individuels sont de haute qualité, elle limite le débit. Deuxièmement, les images devraient être assez propre, qui est exempt de poussière, les taches et les reflets de lumières, comme des signaux associés peuvent aussi confondre l&#39;analyse d&#39;image. Comme il est indiqué dans la section de protocole 2.1.1, un investissement très low-tech qui peuvent grandement aider la capture d&#39;image en éliminant les complications aux fluctuations in éclairage ambiant est de couvrir l&#39;espace scénique avec un tissu sombre qui ne permet pas la lumière ambiante pour atteindre la scène. Troisièmement, le programme est optimisé pour les animaux au stade adulte. Jeune larves nagent très rapidement et ont de petits corps, ce qui augmente l&#39;erreur de programme. Quatrièmement, certains des logiciels utilise MATLAB, et quand il y a des mises à niveau de version et / ou mises à jour du système d&#39;exploitation, des liens de programme peut être perturbé. Actuellement, le logiciel est optimisé pour une utilisation sur MATLAB 2015b et Mac OS la version 10.10, mais nous nous attendons bientôt publier une version du logiciel qui est plus robuste contre ces changements. Enfin, les fichiers de données vidéo peuvent devenir grande vitesse, et nécessitent un espace de stockage à allouer. En résumé, présenté ici est une méthode simple qui peut être facilement mis en œuvre par un laboratoire sans beaucoup d&#39; investissements pour créer des vidéos de C. elegans natation pour l&#39; analyse de Celest. Caractéristiques du logiciel incluent une automatisation du suivi paranalyse simultanée de suivi multi-animal, et l&#39; utilisation de bases mathématiques (c. -à- mesure de courbure) pour la quantification de la plupart des paramètres de locomotion. Le logiciel est open source, avec le code des démos et accessibles au public comme détaillé dans Restif et al. 8. Bien que le programme comporte une analyse avancée de la vision par ordinateur pour le suivi, d&#39; autres systèmes de suivi publié (par exemple, Greenblum et al., 2014 38) sont compatibles avec l&#39;analyse des paramètres du logiciel présenté ici. Les améliorations futures seront dirigées vers la conversion du logiciel dans un paquet plus robuste qui ne restreint pas l&#39; utilisation des versions spécifiques des systèmes d&#39;exploitation mentionnés ci - dessus (également indiquées dans le tableau des matériaux).

Définir comment la génétique, l&#39;épigénétique, l&#39;expérience et l&#39;environnement influencent le comportement est un défi majeur dans la biologie moderne. Simples, des modèles génétiquement justiciables qui peuvent être informatiquement suivis et mesurés peuvent apporter des contributions essentielles pour atteindre cet objectif. Les nématodes Caenorhabditis elegans est un modèle du genre. Le but de cet article est de montrer comment C. elegans natation locomotion peuvent être suivis et quantifiée pour extraire des informations sur huit nouvelles caractéristiques présentant un intérêt biologique. C. elegans a une durée de vie relativement courte d&#39;environ 2 - 3 w et une période de reproduction d&#39;environ 4 jours à 20 ° C 1,2. Dans les cultures de laboratoire standard, ce nématode microscopique est cultivé sur des plaques de Pétri contenant le nématode Growth Media (NGM) qui se propagent avec une source alimentaire bactérienne 3,4. animaux WT N2 se déplacent activement élégantes ondes sinusoïdales sur des plaques d&#39;agar-rempli; ils changent mouvement rates en itinérance (nourriture recherche), logement (navigation), ou la récupération d&#39;un repas (satiété quiescence inactif) 5. Dépréciation 6 ou 7-12 ans peuvent également modifier considérablement le mouvement des plaques. Les gènes qui modulent le comportement, healthspan ou le vieillissement, peuvent être caractérisés fonctionnellement par l&#39; analyse de C. modèles de mouvement elegans ou la locomotion. Une approche pour mesurer healthspan est de classer les adultes vieillissants en trois catégories (par exemple, A, B et C) en fonction de leur locomotion sur des plaques, avec une activité physique vigoureuse étant la classe A et la paralysie étant la classe C 7,8,13. Bien qu&#39;un tel tri qualitatif est utile pour révéler les différences dans la forme physique, les catégories sont larges sans limites claires et donc leur notation est soumise à expérimentateur partialité. Un nombre croissant de trackers ont élevé l&#39;objectivité, la sophistication et la précision de l&#39;analyse de C. elegans mouvementsur des supports solides 14-18. C. elegans locomotion sur les plaques se limite essentiellement au plan dans lequel l&#39;animal est en contact avec la surface solide du support. (C. elegans peut également induire l&#39; exploration en soulevant la tête loin du reste du corps qui est toujours en contact avec une surface solide, le positionnement du corps dans des plans multiples. Toutefois, ce comportement inhabituel.) Lorsqu&#39;il est placé dans un liquide, ce nématode initie un mouvement ondulatoire, ou la natation, qui comporte plus vaste mouvement dimensionnel, une plus grande plage de la vitesse et de la profondeur du mouvement, et une incidence augmente avec l&#39;âge de la antérieure se déplaçant différemment postérieure par rapport aux animaux sur des surfaces solides. Comme une analyse rapide de la condition physique et la réponse à nouvel environnement, un expérimentateur peut placer un animal dans une goutte de liquide et de marquer sa fréquence de courbures du corps dans le champ de dissection. L&#39;enregistrement vidéo peut faciliter scorings actuels et futurs de la vigueur de natation de laanimal. Cependant, l&#39;approche manuelle limite le nombre de fonctionnalités qui peuvent être marqués, et est complètement contraint de marquer un animal à la fois. Locomotion en liquide a été moins exploré que la locomotion sur des milieux solides. En effet, il y a peu d&#39; options logicielles qui sont robustes et faciles à mettre en œuvre dans le laboratoire pour mesurer la locomotion dans un liquide 19-24. Le logiciel Celest (C. elegans Swim Test) offre la simplicité des mesures d&#39;utilisation et de mathématiques à base qui fournissent des données (scores de courbure) directement pertinents à la nature de la motion 8; (description détaillée des caractéristiques et avantages de Restif et al. 8). En outre, l&#39;analyse informatique permet l&#39;élucidation des caractéristiques phénotypiques qui sont impossibles pour l&#39;oeil humain de marquer. Ici, les données qui illustrent la résolution de cette approche d&#39;analyse sont présentés et facile à mettre en œuvre le protocole d&#39;enregistrer les essais de natation pour l&#39;analyse de Celest ultérieure est décrite.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">REAGENT</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td style="width:649px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:484px;">N2</td>
			<td style="width:256px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td>C. elegans wild type (ancestral).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:484px;">OP50 Escherichia coli</td>
			<td style="width:256px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td>Biosafety Level: BSL-1.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:484px;">OP50-1 Escherichia Coli&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td>Streptomycin resistant strain of OP50.&#160; Biosafety Level: BSL-1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Streptomycin sulfate salt</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:375px;">S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Printed Microscope Slides&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:375px;">Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002</td>
			<td>have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:484px;">Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td style="width:256px;">For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving.</td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:484px;">M9 buffer</td>
			<td style="width:256px;">For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving.</td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:375px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">CeleST</td>
			<td style="width:256px;">Driscoll Lab, Rutgers University</td>
			<td style="width:375px;">C. elegans Swim Test</td>
			<td>Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:484px;">MATLAB</td>
			<td style="width:256px;">www.mathworks.com/downloads</td>
			<td style="width:375px;">MatLab version 2015b (best)</td>
			<td style="width:649px;">The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn&#39;t be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn&#39;t need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:484px;">Mac OS</td>
			<td>www.apple.com</td>
			<td style="width:375px;">Version 10.10</td>
			<td style="width:649px;">Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don&#39;t even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it&#39;s the operating system in our lab).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:375px;">Stemi 2000-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Transmitted Light Base</td>
			<td style="width:256px;">Diagnostic Instruments</td>
			<td style="width:375px;">TLB 3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Digital CCD Camera</td>
			<td style="width:256px;">QImaging</td>
			<td style="width:375px;">Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:484px;">Digital Video Recording Software</td>
			<td style="width:256px;">Norpix</td>
			<td style="width:375px;">Streampix Version 3.17.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated analysis of c. elegans swim behavior using celest software

Disséquer les circuits neuronaux et neuromusculaires qui régulent le comportement reste un défi majeur en biologie. Le nématode Caenorhabditis elegans a prouvé être un organisme modèle inestimable pour aider à relever ce défi, d&#39;inspirer des approches technologiques, la construction de la connectome du cerveau humain, à verser effectivement la lumière sur les facteurs moléculaires spécifiques des modèles fonctionnels de base. L&#39;essentiel des études comportementales chez C. elegans ont été réalisées sur des substrats solides. En liquide, les animaux présentent des modèles de comportement qui comprennent le mouvement à une gamme de vitesses en 3D, ainsi que les mouvements du corps partiels, comme une boucle postérieure sans changement de forme antérieure, qui introduisent de nouveaux défis pour la quantification. Les étapes d&#39;une procédure simple, et l&#39; utilisation d&#39;un logiciel qui permet une analyse à haute résolution de C. elegans nager comportement, sont présentés ici. Le logiciel, appelé Celest, utilise un programme informatique spécialisé qui suitplusieurs animaux en même temps et fournit de nouvelles mesures de C. elegans locomotion dans un liquide (natation). Les mesures sont principalement fondées sur la posture animale et basées sur les mathématiques utilisées dans la vision par ordinateur et reconnaissance de formes, sans exigences de calcul pour seuil seuils. L&#39;outil logiciel peut être utilisé à la fois évaluer les prouesses d&#39;ensemble de la natation dans des centaines d&#39;animaux provenant d&#39;essais combinés petits lots et de révéler de nouveaux phénotypes même dans des mutants génétiques bien caractérisés. La préparation des échantillons pour l&#39;analyse avec Celest est simple et low-tech, ce qui permet une large adaptation par la communauté scientifique. L&#39; utilisation de l&#39;approche de calcul décrite ici doit donc contribuer à la meilleure compréhension du comportement et des circuits de comportement dans le modèle C. elegans.

En analysant la locomotion dans un liquide (natation), phénotypes qui ne sont pas évidents sur des milieux solides (ramper) peuvent être élucidés. Pour quantifier la natation locomotion , nous avons développé un logiciel spécifique qui mesure dix nouveaux paramètres du comportement de nage 8. Les huit plus utiles de ces paramètres sont décrits en détail dans le tableau 1. Ces paramètres sont appelés taux d&#39;onde d&#39;initiation, nombre d&#39;onde du corps, Asymétrique, Stretch, Curling, vitesse Voyage, Coup de pinceau, et de l&#39;indice d&#39;activité. Des études illustrant la puissance du logiciel ont défini le déclin fonctionnel des centaines de vieillissement adultes avec WT, antécédents de comportement ou de longévité mutant 8, et ont analysé le bien étudié mutants de longévité âge-1 (hx546) et daƒ-16 (mgDƒ50), qui abritent des mutations qui perturbent la voie de signalisation de l&#39;insuline normale. L&#39;âge-1 gène code pour une phosphatidylinositide 3-kinase (PIK3) Sous - unité catalytique, et, quand il abrite la hx546 de mutation, provoque l&#39; extension de durée de vie et résistance au stress 27-29. Le gène daƒ-16 code pour une boîte de forkhead O (FOXO) facteur de transcription qui raccourcit la durée de vie et altère la réponse au stress lorsque supprimé 30-33. Certains paramètres de natation tels que le taux d&#39; onde d&#39;initiation, la vitesse Voyage, coup de pinceau et de l&#39; indice d&#39;activité progressivement diminué avec l&#39; âge , même dans des contextes génétiques favorables (figure 1). En ligne avec les connaissances actuelles, longue durée de vie à l&#39; âge 1 (hx546) mutants ont montré une performance physique plus vigoureuse que WT à un âge avancé et extrêmement vieux. Aussi comme prévu, de courte durée daƒ-16 (mgDƒ50) mutants affichés compromis performance, surtout au très vieux âges. Remarquablement, ce ne fut que sous le contrôle de la vision de l&#39;ordinateur Celest et package algorithme mathématique que le superior la performance de natation de l&#39; âge-1 (hx546) mutants était détectable au début de l&#39; âge adulte. Le fait que les résultats en amélioration de la performance physique au jeune vie adulte âge-1 (hx546) suggère que cette mutation affecte le développement normal et / ou jeune phénotype adulte d&#39;une manière non précédemment apprécié (Figure 1). Body nombre d&#39;onde, Asymétrie, stretch et curling paramètres ont suivi une tendance avec l&#39; âge dans le WT et le vieillissement des adultes mutants (figure 2). Fait intéressant, le niveau du logiciel de résolution a révélé des traits comportementaux plus fins comme la symétrie soutenue des mutants tout au long de leur durée de vie et l&#39;incapacité des anciens daƒ-16 (mgDƒ50) mutants extrêmes âge-1 (hx546) pour étirer et se recroquevillent dans la mesure où même -AGE WT et l&#39; âge-1 (hx546) adultes. En plus de la perte inévitable de l&#39;ensemble physique performance en raison de l&#39; âge, chaque individu adulte affiche un motif de progression unique à travers le processus de vieillissement, même si la génétique et de l&#39; environnement sont pratiquement homogène 7. (En contrôlant la génétique et de l&#39; environnement, les effets de confusion possibles de ces facteurs sont minimisés, dévoilant la contribution significative de la stochasticité à la dégénérescence liée à l&#39; âge.) A synchronisé C. elegans population d&#39;origine génétique similaire conservé dans un environnement contrôlé contient toujours un mélange de différentes catégories de personnes en fonction de leurs particularités de vieillissement. Bien que commencent tous les adultes en bonne santé, certains perdent rapidement leur forme physique (mauvais agers, classe C) tandis que d&#39;autres maintiennent la vigueur pour une longue période de temps (agers gracieux, classe A). Bad agers semblent donc avoir un healthspan considérablement plus courte que agers gracieux. Comme plus en détail dans notre étude 8, agers gracieux entretenus FITN physique jeuneess observée par comparaison avec le profil de natation de beaucoup plus jeunes adultes (figures 3, 4 et 5). Cette remise en forme soutenue est comparable à la performance physique-1 âge (hx546) mutants à long terme à l&#39; âge post-reproduction (D 11) (figures 1 et 2). Au contraire, les mauvaises agers considérablement perdu beaucoup de leur capacité physique , peu après la reproduction, l&#39; exécution à des niveaux similaires à ceux des anciens et progeric daƒ-16 (mgDƒ50) adultes extrêmes (figures 1 - 4). Ces similitudes peuvent être tirées par rapport brut, les signatures cependant particulières sont facilement perceptibles à regarder de plus près. Par exemple, bien qu&#39;il y ait une certaine corrélation entre l&#39;étendue des deux étirement et le curling dans les anciens types sauvages extrêmes et mutants vieillissement (Figure 2), cette relation n&#39;a pas été observée dans les mauvais agers (figures 4 et 5), qui montrent plus forte propension à se recourber up maisne pas étirer dans les échantillons testés. Le logiciel que nous présentons ajoute ainsi dimension à l&#39;analyse de la condition physique ou de la capacité locomotrice en fournissant les outils pour des études plus sophistiquées qui ne sont pas traitables avant. En résumé, Celest fournit des lectures complètes sous la forme de huit nouvelles mesures mises en évidence ici, qui définissent l&#39;empreinte comportementale de spécifique génétiques, épigénétiques et milieux environnementaux, permettant l&#39;identification des modèles de paramètres uniques et communs qui peuvent être les signatures de conditions spécifiques ( environnement, pharmacologiques, nutritionnels), les processus biologiques, ou organisme états tels que healthspan. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig1.jpg" /> Figure 1: Celest Rapports logiciels sur Vague Initiation Rate (A), indice d&#39; activité (B), Coup de pinceau (C) et Vitesse Voyage (D) pour WT, l&#39; âge-1 (hx546) et daƒ-16 (mgDƒ50)<html> Adultes sur D 4 (jeune adulte), 11 (post-reproduction) et (vieille extrême) 20. &#39;#&#39; Dans le numéro «moyen de l&#39;axe y. WTS sont colorés en gris, âge 1 en vert et daƒ-16 en rouge. Les barres d&#39;erreur sont l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). WT de même âge et des mutants de vieillissement ont été comparés pour la signification statistique à l&#39;aide d&#39;une analyse de variance suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. ** P = 0,001 - &lt;0,01; ***, P = 0,0001 - &lt;0,001. n = 62 dans chaque point de données à partir de quatre essais indépendants. Notez que ici, et pour la figure 2, la vidéo de chaque individu 30 est fait avec 4 animaux, et pour chaque essai , nous marquer un total de 16 animaux à partir de 4 vidéos de natation, ceci est fait pour 4 répétitions biologiques pour chaque point de données indiqué. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <html> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig2.jpg" /> Figure 2: Rapports de logiciels sur le corps Nombre d&#39; onde (A), Asymétrique (B), Stretch (C), et Curling (D) pour WT, l&#39; âge-1 (hx546) et (mgDƒ50) Adultes sur D 4 16 daƒ (jeune l&#39; âge adulte), 11 (post-reproduction) et âgé de 20 (extrême). &#39;#&#39; Dans le numéro «moyen de l&#39;axe y. WT sont colorés en gris, âge 1 en vert, et daf-16 en rouge. Les barres d&#39;erreur sont l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). WT de même âge et des mutants de vieillissement ont été comparés pour la signification statistique à l&#39;aide d&#39;une analyse de variance suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. *, P = 0,01 - &lt;0,05; ** P = 0,001 - &lt;0,01; ***, P = 0,0001 - &lt;0,001. n = 62 dans chaque point de données de quatre indépendants, 30 s nager essais.f.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig3.jpg" /> Figure 3: Rapports de logiciels sur Vague Initiation Rate (A), indice d&#39; activité (B), Coup de pinceau (C), et la vitesse Voyage (D) pour les jeunes adultes WT (D 4), et de même âge Gracieux et Bad agers (D10 et 11). &#39;#&#39; Dans le numéro «moyen de l&#39;axe y. Les jeunes WTS sont colorés en gris, classe A agers gracieux en vert, et la classe C mauvais agers en rouge. Les barres d&#39;erreur sont l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). Catégorie A agers gracieux et classe C mauvais agers ont été comparés à D 4 jeunes adultes à l&#39;aide d&#39;une ANOVA suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. **** P &lt;0,0001. n = 27 dans chaque point de deux indépendants de données, 30 s nager essais. Graphique est légèrement modifié par Restif et al. (2014) 8, qui a été publié sous la CreativeCommons Paternité (CC BY) licence http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig4.jpg" /> Figure 4: Rapports de logiciels sur le corps Nombre d&#39; onde (A), Asymétrique (B), et Curling (C) pour les jeunes adultes WT (D 4), et agers même âge gracieux et Bad (D 10 et 11). &#39;#&#39; Dans le numéro «moyen de l&#39;axe y. Les jeunes WTS sont colorés en gris, classe A agers gracieux dans agers verts et la classe C mauvais en rouge. Les barres d&#39;erreur sont l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). Catégorie A agers gracieux et classe C mauvais agers ont été comparés à D 4 jeunes adultes à l&#39;aide d&#39;une ANOVA suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. ** P = 0,001 - &lt;0,01; **** P &lt;0,0001; <strong&gt; n / a, non applicable depuis un seul animal de la taille de l&#39; échantillon total gondolé. n = 27 dans chaque point de deux indépendants de données, 30 s nager essais. Graphique est légèrement modifié par Restif et al. (2014) 8, qui a été publié sous la Creative Commons Paternité (CC BY) http de licence: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig5.jpg" /> Figure 5: Rapport du logiciel sur stretch pour adultes Jeune WT (D 4), et de même âge Gracieux et Bad agers (D 10 et 11). Les jeunes WTS sont colorés en gris, classe A agers gracieux dans agers verts et la classe C mauvais en rouge. Les barres d&#39;erreur sont l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). Classe A Les agers gracieux et la classe C mauvais agers ont été comparés à D 4 yadultes eunes utilisant ANOVA à sens unique suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. n = 27 dans chaque point de données à partir de deux essais indépendants. Graphique est légèrement modifié par Restif et al. (2014) 8, qui a été publié sous la Creative Commons Paternité (CC BY) http de licence: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Vidéo 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359video1.jpg" /> Vidéo 1: Natation d&#39;un groupe représentatif de C. elegans adultes. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54359/Video1.mov" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)</a> <img alt="Vidéo 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359video2.jpg" /> Vidéo 2: Celest Logiciel de calcul des différents Plans incurvation des Performances Swim des animaux testés. cartes Curvature sont calculées en arrière-plan; ils ne figurent pas dans l&#39;interface logicielle avec l&#39;utilisateur. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54359/Video2.mov" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)</a> <img alt="Vidéo 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359video3.jpg" /> Vidéo 3: calcul du logiciel des mesures de natation individuelles basées sur Cartes Courbure. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54359/Video3.mov" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)</a> <img alt="Vidéo 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359video4.jpg" /> Vidéo 4: Logiciel de calcul des mesures de natation qui ne reposent pas sur CourbureCartes. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54359/Video4.mov" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)</a>

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Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Une méthodologie simple et efficace pour l&#39;analyse par ordinateur du comportement de nage de nématodes dans un liquide est décrit. La méthode ne nécessite que peu ou pas d&#39; investissement pour C. elegans laboratoires. Le matériel utilisé est standard, et le logiciel de l&#39;ordinateur pour l&#39;analyse comportementale (Celest) est une open source un.

Analyse automatisée de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportement Swim Utiliser Celest Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

12.3K vues.  Rutgers University.  Une méthodologie simple et efficace pour l'analyse par ordinateur du comportement de nage de nématodes dans un liquide est décrit. La méthode ne nécessite que peu ou pas d' investissement pour C. elegans laboratoires. Le matériel utilisé est standard, et le logiciel de l'ordinateur pour l'analyse comportementale (Celest) est une open source un. 

Vidéo: Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans</emModèle>

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo laser axotomie en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, une approche novatrice automatisé pour l&#39;analyse oculomotrice

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

The Mouse Forced Swim Test

The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental manipulations that are aimed at rendering or preventing depressive-like states. Mice are placed in an inescapable transparent tank that is filled with water and their escape related mobility behavior is measured. The forced swim test is straightforward to conduct reliably and it requires minimal specialized equipment. Successful implementation of the forced swim test requires adherence to certain procedural details and minimization of unwarranted stress to the mice. In the protocol description and the accompanying video, we explain how to conduct the mouse version of this test with emphasis on potential pitfalls that may be detrimental to interpretation of results and how to avoid them. Additionally, we explain how the behaviors manifested in the test are assessed.

The forced swim test is validated as an experimental approach to assess potential antidepressant efficacy in rodents. Experimental animals are placed in a tank of water and escape-related mobility behavior is quantified. The common procedures for the mouse version of this test are described.

Le test de natation forcée souris

The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Suivi et évaluation comportementale

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenèse

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

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Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans

In vivo laser axotomie en C. elegans

VisioTracker, une approche novatrice automatisé pour l'analyse oculomotrice

Le test de natation forcée souris

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic

C. elegans Suivi et évaluation comportementale

Un indicateur moléculaire de l'adaptation à long terme olfactive dans

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours

Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans