Cet article a été financée par des subventions des NIH à JER. Je tiens à remercier le Dr Alex Gottschalk pour fournir les vers transgéniques exprimant le canal rhodopsine dans les motoneurones cholinergiques utilisés dans l&#39;une des manifestations d&#39;enregistrement.

A. Préparation des outils utilisés pour la dissection. <ol><li> La chambre de dissection / enregistrement: En général, nous construisons notre chambre d&#39;enregistrement dans une feuille 1 / 16 ème magnétiques pouces, avec un trou circulaire percé dans le centre qui est assez grand pour accueillir un diamètre de 22 mm couvercle en verre circulaire. Les dimensions extérieures de la chambre dépendra de la platine du microscope utilisé pour faire des enregistrements. Sur le verso de la feuille magnétique, nous attachons une 48 x 60 mm lamelle, laquelle nous adhérons à la chambre en plaçant une pastille de cire fondue des tissus à faible Paraplax enrobage dans chaque coin de la lamelle en sandwich entre le verre et la chambre . La cire est ensuite fondu sur une plaque chauffante, plaque de verre vers le haut, jusqu&#39;à ce qu&#39;elle forme une couche continue coller la lamelle de la chambre. Ne laissez pas cette étape sans assistance comme la cire fond rapidement. La chambre doit être retiré et refroidi dès que la cire a fondu. L&#39;excès de cire qui a suinté le long du bord intérieur de la cavité circulaire 22mm peut être enlevé en utilisant un tranchant de la lame de rasoir. </li><li> Lamelles Sylgard revêtement: La dissection est réalisée sur un 22 mm, lamelle Sylgard revêtement qui est placé dans la cavité circulaire de la chambre d&#39;enregistrement. Le pelage Sylgard aide de la colle cyanoacrylique adhèrent à la lamelle lors du collage des vers le bas et agit aussi comme un coussin sur lequel briser le dos de la colle la pointe de pipette quand elle devient branchée. Sylgard est composée frais selon les instructions du fabricant (10 pièces à base de silicone à 1 partie de durcisseur en poids). Une petite goutte de Sylgard est ensuite placé sur chaque lamelle et un balayage à l&#39;aide d&#39;un avantage lame de rasoir pour faire une surface plane. Les lamelles enduites sont placées dans de grandes plates contenants couverts et laissés dans un four à 65 ° degrés durant la nuit pour guérir. </li><li> Pipettes: Généralement, nous utilisons les mêmes filaments de 1 mm de diamètre extérieur en verre de borosilicate pour générer les pipettes pour les vers le bas collant, faire des incisions cuticule et enregistrement à partir de muscles, en utilisant un extracteur de l&#39;électrode. Il est conseillé de tirer un pot de pipettes avant de tenter une dissection que cette étape peut nécessiter plusieurs échanges rapides de pipettes. </li><li> Applicateur de colle: Colle est chargé et appliqué à partir de la pointe d&#39;une pipette de la colle, le bouche-pression. La pipette collage est insérée dans une extrémité d&#39;une pièce de 2 pieds de tuyaux en polyéthylène avec un diamètre intérieur qui correspond au diamètre extérieur du verre pipette (généralement de 1 mm). L&#39;autre extrémité du tube est titulaire d&#39;une pointe de pipette Eppendorf qui agit comme un embout buccal. </li><li> Extraction pipette: Les viscères ver doit être retiré de la cavité ver une fois l&#39;incision cuticule a été faite. Ceci est réalisé avec un morceau de tuyau attaché à une pointe de pipette Eppendorf similaire à l&#39;applicateur de colle mais dans ce cas l&#39;extraction de verre pipette est cassé revenir suffisamment pour permettre les œufs et les viscères pour être facilement aspirés hors de la cavité ver. </li></ol> B. La dissection <ol><li> Dans la chambre d&#39;enregistrement d&#39;une ligne de cire circulaires plume est établi à proximité du périmètre de la chambre à laquelle une lamelle Sylgard revêtement est pressé fermement en place (Sylgard-robe vers le haut). Cette ligne de cire immobilise la lamelle et empêche la solution d&#39;enregistrement et de suinter sous déloger la lamelle lors de la dissection et l&#39;enregistrement. La chambre est alors remplie avec une solution d&#39;enregistrement extracellulaire et plusieurs vers sont placés dans le centre en utilisant un pick ver. Worms se baigner dans la solution, mais avec la pratique, ces vers peuvent être collés sans aucune autre procédure, comme le refroidissement pour empêcher le mouvement. Pendant la phase de formation, elle peut aider à la pratique des vers collage mutant dans lequel la natation est altérée (tels que UNC-31 mutants). </li><li> Un récipient de colle façonné à partir d&#39;un bouchon de PCR tenue en cire ou en pâte à modeler, est utilisé pour maintenir un stock de travail de la colle cyanoacrylique. Pipettes colle avec des dimensions similaires à la pointe de la pipette d&#39;enregistrement (normalement ~ 4 mégohms de résistance) sont utilisées pour appliquer la colle. Utilisation de l&#39;applicateur de colle, une petite quantité de colle est aspiré dans la pipette de la colle, en utilisant le champ de dissection pour visualiser la pointe de la pipette que la colle est aspirée. </li><li> La colle cyanoacrylique (HistoacrylBlue, Aesulap) polymérise au contact avec une solution d&#39;enregistrement extracellulaire, il est donc important de maintenir une pression positive sur la pipette de la colle à son entrée dans la solution de chambre pour empêcher la colle de durcir et de brancher la pipette. Dès que la pipette de la colle se trouve dans la solution de la chambre, un petit ruisseau, mais constante, de colle doit être appliquée sur la surface sous la bouche Sylgard pression de contrôle pour éviter de brancher. Si la pipette est branché, il peut parfois être débloqué en tapotant doucement la pointe sur le verre Sylgard-enduit. Il est recommandé que vous pratiquez le collage avant de tenter de les vers de la colle. Si vous ne pouvez régulièrement écrire votre nom dans la colle sur le Sylgard, avec des lettres, fait de lignes plus minces que la largeur des vers que vous êtes prêt à procEED pour le collage des cuticules ver. </li><li> Pour coller un ver, l&#39;utilisation à pression positive pour attacher une petite quantité de colle soit à la tête ou la queue du ver et tirer rapidement le ver le bas sur la surface Sylgard. Essayez de joindre le ver près du centre de la chambre que les vers collés trop près du bord seront difficiles à atteindre avec des pipettes d&#39;enregistrement. Appliquez ensuite un flux constant de colle le long du bord dorsal de la cuticule du ver de l&#39;attachement de départ, forçant le ver dans un C-position avec la vulve vers l&#39;intérieur (pour les enregistrements musculaire ventrale). Toutes les lacunes dans cette ligne de colle doit être rempli en sorte que le ver est fortement attaché, pour empêcher le ver de se détacher pendant l&#39;étape de l&#39;incision cuticule. </li><li> Pour faire l&#39;incision cuticule, passer à la dissection d&#39;une pipette à main. Cette pipette doit être plus forte que la colle / l&#39;enregistrement des pipettes et ont une courte tige robuste. Utilisation de la plus haute grossissement sur la portée de dissection, d&#39;aligner le parallèle pipette à l&#39;axe longitudinal de la vis sans fin et insérez la pointe propos milieu le long de la vis sans fin (proche de la vulve) faire l&#39;incision à l&#39;interface cuticules / colle. Cette incision libère la pression hydrostatique vers forçant les œufs et les intestins par le point d&#39;incision. Continuer la coupe la cuticule vers la tête du ver avec un mouvement de tranchage similaire à l&#39;ouverture d&#39;une lettre, jusqu&#39;à ce que vous atteigniez le pharynx. Passer à la pipette d&#39;extraction à vide sur les organes internes du ver. Après compensation de l&#39;incision, la cuticule a ouvert conservera sa forme cylindrique. Utiliser une pipette encollage frais pour point de soudure du bord coupé de la cuticule vers le bas sur la surface Sylgard. Il est important d&#39;utiliser des points de colle minimale à ce stade pour éviter d&#39;endommager ou de masquer les NMJs. Les muscles ventraux du nerf mur de cordon et le corps sont désormais exposés. </li><li> Pour retirer la membrane basale qui couvre la NMJs, sucer la solution d&#39;enregistrement extracellulaire de la chambre et d&#39;appliquer la collagénase (0.4mg/ml en solution d&#39;enregistrement extracellulaire) pour environ 10-20 secondes, retirer et laver à plusieurs reprises avec une solution d&#39;enregistrement extracellulaire frais. Passez à l&#39;étape de l&#39;enregistrement. </li></ol> C. patch-clamp <ol><li> Position de la chambre d&#39;enregistrement sur une platine de microscope en haut à droite avec un objectif 10X au centre du ver. Passez à une eau-40X émersion objectif avec DIC et vérifier que les muscles de la paroi du corps et le cordon nerveux sont intacts. Position du ver de sorte que l&#39;axe longitudinal du ver est parallèle avec le bord avant de la portée, permettant électrodes sera introduit à partir des deux côtés de la gauche et la droite. </li><li> Patch du muscle en utilisant la norme patch-clamp techniques. Les électrodes d&#39;enregistrement d&#39;environ 4 mégohms de résistance bien travailler. Une fois que l&#39;électrode touche la membrane musculaire, augmentation de pression négative jusqu&#39;à ce qu&#39;un joint gigohm est obtenu. Pour le mode de la cellule entière d&#39;enregistrement voltage-clamp, appliquer plus d&#39;aspiration et de zapper la membrane jusqu&#39;à ce que le joint gigohm est rompu. Dans un bon enregistrement, muscles de la paroi du corps des vers adultes de type sauvage ont généralement une capacité de la membrane cellulaire de ~ 70 pF et peut être stablement enregistrés depuis au moins 10 minutes à un potentiel de maintien de -60 mV avec un minimum de courants de maintien (~ 50 pA). </li><li> La solution d&#39;enregistrement extracellulaire se compose de (en mM): NaCl 150, KCl 5, CaCl2 5, MgCl 2 4, du glucose à 10, saccharose à 5, HEPES 15 (pH 7,3, 330mOsm ~). La pipette de patch contient (en mM): KCl 120, KOH 20, MgCl 2 4, (N-tris [hydroxyméthyl] mthyl-2-aminoéthanethiol-sulfonique) TES 5, dihydraté CaCl2 0,25, Na 2 ATP 4, saccharose 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Remarque: Ces solutions artificiellement la charge cellules musculaires avec du chlorure, de sorte que le récepteur GABA-médiée courants sont étrangers à cause de l&#39;efflux de chlorure à un potentiel de maintien de -60 mV. Variations sur ces solutions ont été utilisés (voir les publications pour les détails). </li><li> Evoqués communiqué. Typiquement nous plaçons une deuxième électrode contenant une solution extracellulaire sur la chaîne nerveuse ventrale antérieure au muscle patché. Cette configuration de patch en vrac doivent grande stimuli dépolarisants (de l&#39;ordre de 10s de volts) de courte durée (1-2ms) pour atteindre maximale réponses évoquées (généralement de 2,0 à 2,5 nA) en vers de type sauvage. Les limites de cette approche sont: 1) Seules quelques réponses évoquées peuvent être livrés avant la moelle épinière est irréversiblement endommagé et 2) Pour des raisons inconnues, seulement cholinergique réponses évoquées peut être obtenue en utilisant cette configuration de stimulation. </li><li> Lumière activé canal rhodopsine stimulation. Récemment, le laboratoire a généré des vers Gottschalk transgéniques exprimant des algues dérivés rhodopsins canal qui dépolariser la membrane sur-stimulation de lumière dans les sous-ensembles de neurones, selon le promoteur utilisé pour diriger l&#39;expression 4. Dans le cas de la C. JNM elegans, les lignes intégrées exprimer canal rhodopsine soit dans les neurones moteurs cholinergiques ou neurones moteurs sont maintenant disponib GABAergiquese. Depuis le canal rhodopsine répond uniquement à la lumière quand tout-trans rétinal est associée à la fraction opsine, vers utilisés pour cette application doit être cultivé sur des bactéries lacées avec de la rétine. Une impulsion de lumière verte peut ensuite être utilisé à plusieurs reprises activer la rhodopsine canaux provoquant la libération évoquée d&#39;acétylcholine soit ou GABA, selon lesquelles les vers transgéniques sont utilisées. Ces vers transgénique peut être franchi dans les souches mutantes. L&#39;avantage de cette technique par rapport à la stimulation précédente électriques comprennent: 1) Lumière-activation ne provoque pas de lésions neuronales, permettant des stimulations répétées de nombreux à effectuer et 2) évoqués libération de deux neurones moteurs GABAergiques ou cholinergiques peuvent être indépendamment étudiés. </li><li> Hyperosmotiques induite par la libération. Pour mesurer la taille de la piscine vésicules facilement libérable (reflétant la piscine résumé des vésicules apprêté de tous les JNM sur le muscle enregistré), une pression pipette contenant hyperosmotiques solution extracellulaire (ajusté à ~ 850 mOsm par addition de saccharose supplémentaires) est utilisé. Pression d&#39;impulsion des applications de 1-3 secondes de produire un barrage de asynchrones post-synaptique des événements en utilisant les solutions standard décrit ci-dessus. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/1165_2009_1_22_3/figure1.png" alt="" width="600" height="449" /> Figure 1: Présentation schématique de la C. Dissection elegans et la configuration d&#39;enregistrement neuromusculaire Une lamelle Sylgard revêtement faite en enduisant une goutte de Sylgard à travers le verre et le durcissement est nuit placée dans la cavité circulaire de la chambre d&#39;enregistrement préfabriqués et couvert avec une solution d&#39;enregistrement. Un ver placé dans le centre est collé à la surface Sylgard à partir de la tête ou la queue, appliquer la colle sur la face dorsale du ver, en utilisant une pipette de la colle,. Une fois le collage est terminé, une incision à côté de la vulve, à l&#39;interface entre la cuticule et de la colle est faite avec une aiguille de verre et étendu vers la tête (voir la ligne rouge perforé). Suite à l&#39;extraction des viscères et les œufs de la cavité du corps, le bord coupé de l&#39;incision est soudée avec de la colle à l&#39;exposant le Sylgard nerveuse ventrale (en vert) et muscles de la paroi du corps (en rouge). Le muscle ventral-médiale antérieure à la vulve est patch-serré et l&#39;électrode de stimulation est placée en amont sur la moelle épinière. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1165/Reprensentative.png" alt="Figure Represenative" width="600" height="404" /> Cellules entières, tension serré enregistrements paroi musculaire du corps sont présentés pour chacun des trois protocoles de stimulation décrit ci-dessus (électriquement évoqués, la lumière et les réponses évoquées hyperosmotiques). Dans tous les cas, le muscle ventral-médiale du corps mur est serré à -60 mV. Cellules musculaires A. type sauvage présentent généralement des taux élevés de l&#39;intérieur endogènes miniatures courants synaptiques dans nos solutions d&#39;enregistrement standard. B. Une dépolarisation 2ms de la corde nerveuse ventrale antérieure provoque la libération synchrone de plusieurs synapses résultant en une réponse de grande d&#39;environ 2 à 2,5 évoqué nA vers de type sauvage. Représentant des traces à la droite des traces de type sauvage dans A et B montrent la libération synaptique dans un grave manque de coordination mutant (UNC-18). Panel C montre une réponse légère évoquée à partir de la jonction neuromusculaire d&#39;un ver de type sauvage exprimant le canal rhodopsine dans les neurones cholinergiques. Une impulsion de lumière 2ms produit typiquement une réponse de 1.5 à 1.8 nA. D. pression d&#39;éjection de 850 mOsm salines hyperosmotiques sur le muscle pour 1s, produit un barrage asynchrone des miniatures représentant des courants synaptiques de la piscine facilement libérable de vésicules.

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La génétique organisme modèle C. elegans est idéalement adapté pour l&#39;étude de la transmission synaptique, à travers l&#39;analyse fonctionnelle des mutations dans des gènes codant pour des protéines synaptiques. Ici, nous avons décrit une technique de dissection qui rend le C. elegans NMJs accessibles pour l&#39;analyse électrophysiologique. La vidéo d&#39;accompagnement décrit les étapes critiques dans le C. Dissection elegans et la configuration d&#39;enregistreme...

dissecting and recording from the c. elegans neuromuscular junction

Neurotransmission est le processus par lequel les neurones transfert d&#39;informations via des signaux chimiques pour leurs études post-synaptique des cibles, sur une échelle de temps rapide. Ce processus complexe nécessite l&#39;activité coordonnée de nombreuses protéines pré-et post-synaptiques appropriés pour assurer la connectivité synaptique, la conduction des signaux électriques, le ciblage et l&#39;amorçage des vésicules de sécrétion, de détection de calcium, la fusion des vésicules, la localisation et la fonction des récepteurs post-synaptiques, et enfin, le recyclage mécanismes. Comme neuroscientifiques notre objectif est d&#39;élucider les protéines de fonction dans chacune de ces étapes et de comprendre leurs mécanismes d&#39;action. Enregistrements électrophysiologiques des synapses fournir une quantifiables lecture des événements sous-jacents électriques qui se produisent pendant la transmission synaptique. En combinant cette technique avec la gamme puissante d&#39;outils moléculaires et génétiques disponibles pour manipuler les protéines synaptiques en C. elegans, nous pouvons analyser les changements résultant fonctionnelle dans la transmission synaptique. Le C. elegans NMJs formé entre les motoneurones et paroi du corps de contrôle des muscles de locomotion, par conséquent, les mutants avec des phénotypes coordination locomotrice (connu sous le nom UNC s) souvent la transmission synaptique à ces perturbent une synapses. Depuis mutants unc sont maintenus sur une alimentation riche d&#39;une source de nourriture des bactéries, elles restent viables tant qu&#39;ils conservent une certaine capacité de pompage du pharynx à ingérer des aliments. Ceci, combiné avec le fait que C. elegans existent comme hermaphrodites, leur permet de passer sur la descendance mutante, sans la nécessité d&#39;élaborer un comportement d&#39;accouplement. Ces attributs, associés à notre capacité récente d&#39;enregistrer à partir des vers NMJs 2,3,7 rendre cet organisme modèle dans lequel une excellente pour répondre avec précision comment la neurotransmission unc l&#39;impact des mutants. La méthode de dissection consiste à immobiliser les vers adultes à l&#39;aide d&#39;une colle cyanoacrylique afin de faire une incision dans la cuticule ver exposer le NMJs. Depuis C. adultes elegans ne sont que 1 mm de longueur de la dissection est réalisée avec l&#39;utilisation d&#39;un microscope à dissection et nécessite une excellente coordination œil-main. JNM enregistrements sont effectués par la cellule entière de tension de serrage des cellules individuelles du corps paroi musculaire et la libération des neurotransmetteurs peuvent être évoqués en utilisant une variété de protocoles de stimulation dont la stimulation électrique, activé par la lumière canal rhodopsine médiée par la dépolarisation 4 et salines hyperosmotiques, qui sera brièvement décrites.

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Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Application de l&#39;électrophysiologie aux synapses accessible fournit une mesure quantifiable de l&#39;activité synaptique, utiles dans l&#39;analyse des mutants synaptique. Cet article décrit une méthode de dissection utilisée pour exposer la jonctions neuromusculaires (JNM) de<em&gt; Caenorhabditis elegans (C. elegans)</em&gt; Et aborde brièvement certaines des utilisations auxquelles cette préparation peut être appliquée.

Dissection et d&#39;enregistrement de la jonction neuromusculaire C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

dissecting-and-recording-from-the-c-elegans-neuromuscular-junction

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K vues.  University of Illinois, Chicago. Application de l'électrophysiologie aux synapses accessible fournit une mesure quantifiable de l'activité synaptique, utiles dans l'analyse des mutants synaptique. Cet article décrit une méthode de dissection utilisée pour exposer la jonctions neuromusculaires (JNM) de Caenorhabditis elegans (C. elegans) Et aborde brièvement certaines des utilisations auxquelles cette préparation peut être appliquée.

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Recherche

Biologie

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualiser le Live Drosophile Gliales-jonction neuromusculaire avec des colorants fluorescents

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Création d&#39;environnements gazeux définies pour étudier les effets de l&#39;hypoxie sur la<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un procédé de culture embryonnaire<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellules

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l&#39;utilisation des Métazoaires organisme modèle<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Dissection et d'enregistrement de la jonction neuromusculaire C. Elegans

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Visualiser le Live Drosophile Gliales-jonction neuromusculaire avec des colorants fluorescents

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

De base

Création d'environnements gazeux définies pour étudier les effets de l'hypoxie sur la

C. elegans Chemotaxis Assay

Un procédé de culture embryonnaire

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans

Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l'utilisation des Métazoaires organisme modèle