Nuestra investigación aprovecha el modelo de pez cebra para estudiar los trastornos de la sangre humana, centrándose en la identificación de nuevos biomarcadores, dianas terapéuticas y tratamientos para enfermedades como la leucemia. Al utilizar las ventajas únicas del pez cebra, nuestro objetivo es explorar los mecanismos moleculares que subyacen a las enfermedades hematológicas y desarrollar estrategias terapéuticas innovadoras para mejorar los resultados de los pacientes. La inyección intravenosa en peces cebra adultos es un desafío debido a su pequeño tamaño y vasculatura compleja.
Hemos desarrollado un método de inyección intravenosa optimizado para la administración precisa y eficiente de sustancias o células en el pez cebra adulto. En comparación con la inyección intracardíaca y retroorbitaria, el método intravenoso que presentamos aquí resultó en una mejor supervivencia de los peces y un mejor injerto celular. Este método hace que el pez cebra adulto sea más utilizable para estudios a no término.
Superando algunos límites de los nuevos modelos, la técnica intravenosa mejorada aumenta la precisión de los modelos de enfermedades y los cribados de fármacos, lo que ayuda a avanzar en nuevas terapias. Para comenzar, coloque el pez cebra transgénico mpo:EGFP sacrificado en una mesa de disección. Disecciona el pez cebra para aislar la médula renal.
A continuación, transfiera la médula renal a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga medio de suspensión celular. Pipetear la suspensión para disgregar las células de la médula renal. Filtre la suspensión celular a través de un colador de células de nailon de 40 micrómetros.
A continuación, centrifugar las células a 500 g durante ocho minutos y desechar el sobrenadante, antes de volver a suspender el pellet en 500 microlitros de medio de suspensión celular. Usando un contador de células automatizado, cuente las celdas con una alícuota de 10 microlitros. Lave a fondo la jeringa Hamilton tres o cuatro veces con etanol al 75%.
A continuación, enjuague la jeringa tres o cuatro veces con agua ultrapura para asegurarse de que se eliminen todos los residuos de etanol. Después de administrar anestesia al pez cebra, confirme la profundidad de la anestesia mediante la disminución del movimiento y la pérdida de las respuestas reflejas. Coloque el pez con el lado dorsal hacia arriba con la cabeza orientada hacia la izquierda sobre papel de seda limpio y húmedo para estabilizar para la inyección.
Sujete firmemente la jeringa Hamilton e incline la aguja aproximadamente 45 grados con respecto a la vena caudal. En el caso del pez cebra Casper, apunte a una sección visible de la embarcación a través del cuerpo translúcido. Inserte suavemente la aguja en el vaso y administre dos microlitros de células de médula renal completa aisladas de pez cebra transgénico mpo:EGFP.
Después de la inyección, aplique una presión suave en el lugar de la inyección con un bastoncillo de algodón durante 10 segundos para controlar el sangrado. Observe el pez cebra inyectado bajo un microscopio para confirmar las señales de GFP dentro de la embarcación. Deje que el pez cebra inyectado se recupere en agua de pescado recién esterilizada durante 10 minutos.
Luego transfiera el pez a un tanque estático. El método de inyección intravenosa produjo la tasa de éxito más alta con señales de GFP visibles en 41 de los 43 peces. Mientras que el método retroorbital detectó GFP solo en tres de 37 peces, el método intracardíaco mostró éxito en 11 de 40 peces.
El método de inyección intravenosa dio lugar a mejores tasas de supervivencia en los peces inyectados, especialmente con dosis celulares más altas en comparación con los métodos retroorbital e intracardíaco. Las señales de GFP se detectaron ya al tercer día después del trasplante en peces inyectados por vía intravenosa, mientras que los métodos retroorbitales e intracardíacos mostraron un retraso en el inicio de la señal de GFP. Para el día 17, los peces inyectados por vía intravenosa mostraron las señales de GFP más prominentes en la médula renal.
La citometría de flujo de la médula renal mostró alrededor del 18% de células positivas para GFP en peces inyectados por vía intravenosa con tres veces 10 a la potencia de cinco células, alineándose con los niveles de GFP en la médula renal del donante. Por el contrario, los métodos intracardíaco y retroorbitario mostraron células positivas para 5% y 2% de GFP, respectivamente.
