Nuestra investigación se centra en enfermedades neurodegenerativas progresivas caracterizadas por la acumulación de la proteína nuclear TDP-43 en el citoplasma, como la ELA o la FTLD-TDP. Nuestro objetivo es comprender cómo las patologías de TDP-43 se propagan a través del cerebro de una manera similar a un prión. Previamente encontramos que la liberación de TDP-43 a través de vesículas extracelulares está mediada por la desregulación de la autofagia.
La progranulina de FTLD-TDP facilita este proceso. El siguiente reto es esclarecer cómo la autofagia regula la producción y liberación de vesículas extracelulares que contienen TDP-43, lo que podría conducir al descubrimiento de dianas terapéuticas para la ELA o FTLD-TDP. Para comenzar, tome las células HeLa cultivadas, cuéntelas usando un contador de células y siembre una vez diez a la potencia de seis células en una placa de seis centímetros que contenga un medio de cultivo.
Incubar las celdas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y humedad controlada durante 24 horas. A continuación, prepare una solución de siRNA de 20 micromolares. Mezcle 100 microlitros de medio sérico reducido y tres microlitros de siRNA en un tubo de baja retención para preparar la solución A. Luego, mezcle 100 microlitros de medio sérico reducido y cinco microlitros de reactivo de transfección en un tubo de baja retención para preparar la solución B. Después de eso, mezcle la solución A y la solución B, luego incube la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Ahora agregue la mezcla de soluciones A y B al medio utilizado para cultivar células HeLa e incube durante 24 horas. Al día siguiente, lavar las células con PBS y exponerlas a 500 microlitros de tripsina al 0,25% y una solución de EDTA milimolar a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% y humedad controlada durante cinco minutos. A continuación, añada 2,5 mililitros del medio de cultivo a las células y, con una pipeta de transferencia Pasteur con una punta de pipeta de 20 microlitros acoplada, prepare una suspensión unicelular.
Después de contar las células, siembre una por diez a la potencia de seis células en un plato de diez centímetros e incube, como se demostró anteriormente. Al final de la incubación, prepare el medio de cultivo que contenga bafilomicicina A1 vehículo o 100 nanomolares. A continuación, exponga las células al medio que contenga bafilomycina A1 de 100 nanomolares e incube durante 24 horas. Al día siguiente, recoja todo el medio de cultivo de la placa de 10 centímetros.
Transfiera el medio recolectado a un tubo de 15 mililitros y centrifuérrelo a 3.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los restos celulares. Para aislar la fracción de vesícula extracelular P1, transfiera el sobrenadante después de la centrifugación a 3.000 G a un tubo de centrifugación. Centrifugar el tubo a 20.000 g a cuatro grados centígrados durante una hora.
Para el aislamiento de la fracción de vesícula extracelular P2, transfiera el sobrenadante después de la centrifugación a 20.000 G a un tubo ultracentrífugo. Centrifugar a 110.000 g a cuatro grados centígrados durante una hora. Después de limpiar el exceso de humedad dentro del tubo con una toallita de laboratorio, vuelva a suspender los gránulos restantes en el tubo de centrifugación en 50 microlitros de tampón de muestra de dos tiempos para preparar la fracción de vesícula extracelular P1.
A continuación, retire el sobrenadante por decantación. Limpie el exceso de humedad dentro del tubo con una toallita de laboratorio y vuelva a suspender los gránulos restantes en el tubo de ultracentrifugación en 50 microlitros de tampón de muestra de dos tiempos para preparar la fracción de vesícula extracelular P2. Incubar las fracciones de vesículas extracelulares P1 y P2 a 100 grados centígrados en un bloque de calor durante 10 minutos.
Después de transferir el medio de cultivo de la placa de 10 centímetros a un tubo de 15 mililitros, lave las células en el plato de 10 centímetros con PBS. A continuación, exponga las células a dos mililitros de tripsina al 0,25% y una solución de EDTA milimolar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y humedad controlada durante cinco minutos. Agregue ocho mililitros de medio de crecimiento a las células.
Con una pipeta de transferencia Pasteur con una punta de pipeta de 200 microlitros acoplada, pipetee las células para preparar una suspensión unicelular. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 1.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, retire el sobrenadante con un aspirador.
Añadir PBS al pellet de la célula y centrifugar a 1.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de eliminar el PBS, sonique el pellet de la célula en un mililitro de tampón A68 que contenga 1% de sarcosil. Mezcle 300 microlitros del lisado celular con 100 microlitros de tampón de muestra de cuatro veces.
Incubar la mezcla a 100 grados centígrados en un bloque de calor durante 10 minutos para preparar la fracción celular.
