Evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante el bioensayo reportero de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos

Es bien sabido que la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos es un mecanismo importante por el cual los anticuerpos ejercen ciertos efectos inmunomediados. Por lo tanto, queremos encontrar un mejor método para probar la eficacia de un fármaco de anticuerpos en el tratamiento del cáncer, mediante el uso de ADCCSA. El protocolo es rápido y sencillo.

Mediante el uso de un protocolo simple de mezcla y lectura, podemos obtener el resultado en un día, lo que agiliza la investigación. Mediante el uso del bioensayo ADCC, podemos realizar un cribado masivo de fármacos de anticuerpos terapéuticos con mayor precisión. La relación señal/ruido del ensayo es alta, lo que puede ayudar a evaluar con precisión el anticuerpo terapéutico.

Para empezar, cultivar, los linfocitos T diana BHT 101 y SW 1736 hasta que alcancen el 80% de confluencia en matraces T75. Después de retirar el medio, lavar las células una vez con PBS e incubarlas con un mililitro de tampón de disociación celular no enzimática durante cinco minutos. Agregue PBS para detener la reacción.

Gire las celdas a 135 G durante cinco minutos y luego agregue cinco mililitros de PBS. Determine el recuento de células y siembre las células a 15.000 células por pocillo en microplacas de poliestireno blanco de 96 pocillos con un fondo transparente y plano. Para empezar, prepare los linfocitos T diana BHT 101 y SW 1736 para el ensayo.

A continuación, prepare Cetuximab para unirse al receptor del factor de crecimiento epidérmico y Bevacizumab como control negativo. Para hacer el tampón de bioensayo ADCC, agregue 1,4 mililitros de suero de inmunoglobulina G baja en 33,6 mililitros de RPMI 1640, como se suministra en el kit. Con el tampón, diluya los anticuerpos para preparar 400 microlitros de cada anticuerpo en tres concentraciones diferentes.

Precaliente el tampón de bioensayo ADCC en un baño de agua a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos. Retire las células efectoras del bioensayo ADCC del almacenamiento en frío a menos 80 grados Celsius y colóquelas en un baño de agua a 37 grados Celsius durante aproximadamente dos o tres minutos. Mecine suavemente e inspeccione visualmente el vial sin invertirlo durante el proceso de descongelación.

A continuación, transfiera 630 microlitros de células efectoras a un tubo de 15 mililitros, que contiene 3,6 mililitros de tampón ADCCSA. Invierta suavemente el tubo dos veces para mezclar las células con el tampón. Para empezar, prepare las células diana, las células efectoras y los anticuerpos deseados para el ensayo ADCC.

Después de la incubación durante la noche, retire los medios de las células objetivo y agregue 25 microlitros de tampón de bioácido ADCC seguidos de 25 microlitros de antagonistas a los pocillos apropiados. A continuación, añada 75.000 células defectuosas en 25 microlitros de tampón de bioensayo ADCC por pocillo en la microplaca de 96 pocillos que contiene las células objetivo, e incube la placa durante seis horas a 37 grados centígrados. Para preparar el reactivo de ensayo de luciferasa, agregue tampón de ensayo de luciferasa al sustrato del ensayo de luciferasa liofilizado.

A continuación, añada 75 microlitros del reactivo de ensayo de luciferasa a cada pocillo de la placa que contenga células objetivo, anticuerpos y células efectoras e incube la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Usando un luminómetro, mida la señal de luminiscencia en cada pozo para proporcionar una lectura cuantitativa de la actividad de ADCC. Para el análisis de datos, calcule la inducción del pliegue utilizando la fórmula.

Cetuximab indujo una mayor actividad de ADCC en todas las concentraciones probadas, pero no se detectó actividad de ADCC con bevacizumab en ninguna de las líneas celulares BHT 101 y SW 11736, lo que demuestra el efecto de ADCC de dirigirse a los antígenos de membrana extracelular de EGFR para ambas líneas celulares.