Técnica para el aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea de mandíbula de rata

Este estudio proporciona un método eficaz y estable para obtener suficientes células madre mesenquimales de médula ósea maxilar de alta calidad con una fuerte capacidad de diferenciación en poco tiempo. El método basado en nicho se puede aplicar en el aislamiento de células madre mesenquimales de médula ósea de rata. Nuestro estudio aísla con éxito células madre mesenquimales de médula ósea maxilar de alta pureza, ofreciendo una fuente celular sustancial para la ingeniería de tejidos óseos mandibulares, particularmente en el contexto de la reparación de defectos óseos.

Estos avances son muy prometedores para el campo. Para empezar, extrae una mandíbula de rata de una rata sacrificada. Coloque el pico de rongeurs en la unión de los incisivos de la mandíbula de una rata extraída y el primer molar.

Corta la conexión entre los incisivos inferiores y la mandíbula, luego extrae los incisivos inferiores por completo. Retira todos los molares, seguidos de la rama mandibular. Ahora separe la parte central de la mandíbula a lo largo del borde distal del último molar y exponga la cavidad medular.

A continuación, llene una jeringa desechable de un mililitro con medio completo alpha MEM. Inserte la aguja en la cavidad de la médula ósea. Enjuague la médula ósea repetidamente en una placa de cultivo que contenga medio alfa MEM completo hasta que el hueso se vuelva blanco.

Transfiera la solución enjuagada a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar la solución a 800 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizada la centrifugación, pipetee el sobrenadante y, a continuación, añada 10 mililitros de medio completo alpha MEM al tubo.

Vuelva a suspender el pellet en el medio y transfiera la suspensión a un nuevo plato de cultivo de 10 centímetros de ancho. Ahora use un rongeur de hueso para dividir la mandíbula enrojecida en rodajas de hueso. Transfiera las rodajas de hueso a un tubo que contenga tres mililitros de solución de colagenasa tipo II al 0,1%.

Coloque la mezcla de rodajas de hueso en una coctelera durante 90 minutos a 37 grados centígrados y 200 RPM. Una vez finalizada la incubación, centrifugar la mandíbula digerida a 800 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Pipetear el sobrenadante para desecharlo, luego transfiera las células recolectadas y las rodajas de hueso digeridas a placas de pocillos que contengan 10 mililitros de medio completo alfa MEM.

Incubar los cultivos a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada bajo un 5% de suplementación de dióxido de carbono. Después de 72 horas, reemplace la mitad del medio de cultivo con medio fresco. Cuando las células adherentes tengan un 80 a un 90% de confluentes, páselas en una proporción de uno a dos.

Retire las rodajas de hueso durante el segundo subcultivo. Después de 72 horas de cultivo, la mayoría de las celdas estaban suspendidas y redondas, con unas pocas adheridas a la pared. Las colonias adherentes que eran husos o similares a fibroblastos aparecieron después de cinco días de cultivo.

Las células adherentes alcanzaron el 90% de confluencia al séptimo día y formaron una forma de banco de peces. Las células conducidas mostraron homogeneidad, tenían predominantemente forma de huso y en un patrón similar a un vórtice después de la confluencia.