Cuantificación en tiempo real de los efectos de la TnpB asociada a la familia IS200/IS605 sobre la actividad de transposones

Este protocolo nos permite cuantificar las estadísticas de escisión sobre una sola célula, en lugar de observar el comportamiento masivo. En este nivel, podemos rastrear el comportamiento de las células individuales a lo largo del tiempo, incluidos sus niveles de TnpA y TnpB para las células que se extirpan frente a las células que no lo hacen, lo que puede permitirnos, por ejemplo, medir los efectos de los eventos mutacionales identificados en la tasa de crecimiento. Este método es una forma simple y de bajo costo de medir la dinámica mutacional de células vivas.

El enfoque general es aplicable a cualquier sistema que requiera imágenes fluorescentes de células vivas. Prepara un portaobjetos hirviendo M63 con 0,5% de glucosa y 1,5% de agarosa en el microondas para derretir la agarosa. Asegúrese de que el medio esté completamente fundido y bien mezclado.

Deje que la mezcla se enfríe a 55 grados centígrados antes de agregar antibióticos e inductores. Coloque un portaobjetos de microscopio en el banco de trabajo. Apile una diapositiva perpendicular a la primera.

Asegúrese de que haya un espacio igual a un grosor de diapositiva entre la diapositiva inferior y superior. Pipetea un mililitro de la mezcla de agarosa M63 en el espacio entre la diapositiva lentamente para crear un pequeño cuadrado de gel. Una vez que el gel se haya solidificado, deslice el portaobjetos superior para retirarlo.

Recorte la almohadilla de agarosa con una hoja de afeitar o un cuchillo. Luego, pipetea 2.5 microlitros del cultivo bacteriano y coloca el cubrebocas en la parte superior. Selle el espacio entre la corredera y el cubreobjetos con epoxi.

Deje que el epoxi se seque y las células se depositen en la almohadilla de agarosa durante una hora a 37 grados centígrados. Coloque la muestra preparada en un microscopio de fluorescencia en un ambiente calentado y mantenido a 37 grados centígrados. Para cada longitud de onda, encuentre el campo de visión que contiene fluorescencia mínima.

Configure un protocolo para adquirir imágenes en una cuadrícula en diferentes longitudes de onda y en intervalos de tiempo regulares. Los eventos de escisión de transposones resultan en la reconstitución del promotor para mCerulean3, permitiendo la identificación de células sometidas a actividad de transposón por fluorescencia azul brillante. TnpB mejora la tasa de escisión de transposones.

Las células que expresan la proteína accesoria TnpB experimentan niveles de cuatro a cinco veces más altos de actividad de transposones en comparación con las células TnpB negativas. En las células TnpB positivas, las células sometidas a eventos de escisión de transposones tienen niveles de expresión más altos de mCherry TnpB que la población general. Además, para las células sometidas a eventos de escisión, las células TnpB positivas expresan solo niveles marginalmente más altos de TnpA-transposasa venosa que las células TnpB negativas, que es más alta que la fluorescencia amarilla de la población general.

El lugar más probable para luchar es en la preparación del cultivo celular para el experimento. Debe asegurarse de que las células crezcan hasta la fase exponencial y que el portaobjetos se inocule con un número adecuado de células. Recuerde tener cuidado con las burbujas al sellar el portaobjetos para que el gel de agarosa no se seque.