La mayoría del trabajo básico y traslacional proviene de animales anestesiados. Los anestésicos pueden agregar variables de confusión al análisis e interpretación de los datos. Este trabajo permite imágenes despiertas en ratas para eludir ese problema.
Este diseño es bastante simple. Todo el conjunto es liviano, por lo que no perjudica la vida normal del animal. Esto significa que también se puede utilizar para imágenes crónicas a largo plazo.
Ayudando a demostrar este procedimiento estará el Dr. Mehwish Bhatti, un postdoctorado senior de nuestro laboratorio. Comience haciendo el implante de cabeza utilizando software CAD para obtener imágenes del área posterior a la bregma y adyacente a la línea media centrada en la corteza somatosensorial. Asegúrese de que el implante de cabeza cubra un área de 0.9 a 1.9 milímetros en el cráneo lejos del área de imágenes.
Use solo tres tornillos para anclar el implante de cabeza en el cráneo de la rata. Diseñe todos los orificios de tornillo en el lado opuesto de la línea media en la parte contralateral del hemisferio de la imagen. Para permitir que los cables fijen la tapa de la cabeza al implante de cabeza, coloque una barra hueca en la parte superior del implante de cabeza.
A continuación, diseñe la tapa, asegurándose de que cubra el área de imágenes por completo y la proteja de cualquier trauma. Agregue una curvatura a la tapa de la cabeza para que se alinee con la forma de la cabeza sin causar dificultad a las actividades diarias del animal en las jaulas enriquecidas estándar. Corte el lado interno de la tapa de la cabeza en una forma rectangular más ancha para que la parte superior del implante de cabeza pueda encajar en ella.
Perpendicular a este rectángulo, corte otras dos regiones rectangulares para anclar la tapa de la cabeza al implante de cabeza. Para fijar la tapa de la cabeza de la rata, pase los cables a través de la barra hueca superior del implante de cabeza. Diseñe el marco de la cabeza de modo que una parte cortada pueda moverse a través de la barra superior del implante de cabeza y se fije con una abrazadera.
Para que el lado contralateral sea accesible para obtener imágenes, incline la otra parte cortada para proporcionar resistencia adicional para mantener fija la cabeza de la rata. Imprime el implante de cabeza y la tapa de la cabeza con la impresora 3D. Medir el peso del animal para calcular la cantidad de anestesia a administrar.
Anestesiar al animal inyectando pentobarbital sódico por vía intraperitoneal. Se pueden usar varias alternativas de anestesia en esta cirugía, como isoflurano, ketamina o xilazina. Inyecte atropina por vía intramuscular para reducir las secreciones de moco mientras respira.
Usando un recortador de pelo, afeite la cabeza de la rata comenzando entre los ojos hasta la parte posterior de las orejas cinco milímetros centrados alrededor de la línea media. Luego controle la saturación parcial de oxígeno y la frecuencia cardíaca con un oxímetro de pulso y una sonda de monitor de frecuencia cardíaca asegurada a la pata trasera de la rata. Limpie la cabeza de la rata y el área circundante tres veces con Betadine y toallitas con 70% de alcohol alternativamente.
Arregla la rata en un sistema estereotáxico. A continuación, inserte una sonda rectal lubricada con vaselina para medir la temperatura corporal de la rata y mantenerla a través del sistema de retroalimentación de la manta térmica para evitar la hipotermia después de la administración de anestesia. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar que se seque.
Administrar anestésico local al 2% por vía subcutánea sobre el sitio quirúrgico y tres milímetros de solución de Ringer lactato a temperatura ambiente por vía subcutánea para prevenir la deshidratación y proporcionar nutrición durante la cirugía. Con tijeras quirúrgicas afiladas, retire la parte de la piel sobre el sitio quirúrgico. Diseccionar y eliminar parte de la piel entre la oreja y el ojo en la parte temporal de la cabeza.
Con un bisturí, retire el tejido de la piel subyacente para exponer el cráneo. Luego limpie el cráneo con una gasa de algodón esterilizada. Corte el músculo temporal y exponga el área del cráneo en el hemisferio contralateral para el implante de cabeza.
Coloque el implante de cabeza en el cráneo para determinar la ubicación de los tornillos de anclaje para el implante. Ahora marque el cráneo con tinta china para perforar los tornillos con la broca uno. Perfore los orificios de rebabas para los tornillos con la broca dental tres y atornille el implante de cabeza en su lugar.
Seque el cráneo con una gasa estéril y aplique una capa delgada de adhesivo tisular alrededor y debajo del implante de cabeza para pegarlo al cráneo. Use cemento dental para apoyar el implante de cabeza en su lugar y deje que el cemento se seque durante dos o tres minutos. Además, use la broca dental tres para disminuir el grosor de un área de 7.5 milímetros por 7.5 milímetros en el lado izquierdo del cráneo justo después del bregma y lateral a la línea media a 50 micrómetros.
Aplique ungüento antibiótico tópico sobre el sitio quirúrgico y luego cúbralo con una capa delgada de caucho de silicona para proteger el cráneo delgado. A continuación, cubra el sitio quirúrgico con la tapa de la cabeza y fíjela en su lugar con los dos pequeños trozos de cables que atraviesan tanto el implante de cabeza como la tapa de la cabeza. Aplique caucho de silicona para cubrir la tapa de la cabeza y el cráneo para estabilizar la tapa de la cabeza más en la cabeza de la rata.
Administrar buprenorfina y antibióticos por vía intraperitoneal para controlar el dolor y la inflamación y prevenir la infección, respectivamente. Se muestran las señales de imagen óptica de la respuesta sumada de una rata despierta y un solo ensayo de una rata anestesiada. La respuesta funcional de la rata fija con cabeza despierta es 140 veces más fuerte que la de la rata anestesiada.
Tenga cuidado de no agregar demasiado cemento sobre la placa de cabeza. Puede obstruir la fijación adecuada de la tapa. Este método se puede aplicar ampliamente a la neuroimagen de cráneo delgado fijo con cabeza despierta.
Con las craneotomías, se puede extender a otros protocolos de neuroimagen, incluidas las imágenes de ultrasonido funcional, las imágenes de calcio y las imágenes de fluorescencia. Las imágenes despiertas permitirán un nuevo cuerpo de trabajo sin las variables de confusión introducidas con los anestésicos.
