Este protocolo proporciona una comprensión multifacética de la activación de los procesos de muerte celular, que puede proporcionar información crítica sobre los mecanismos de la enfermedad e informar estrategias terapéuticas. Este protocolo se basa en el uso de una técnica más sencilla y para acceder a la activación de múltiples caspasas imperativo de una sola población de células endógenas para determinar en gran medida la activación. La muerte celular inmune innata se ha implicado en todo el espectro de la enfermedad, desde infecciones hasta enfermedades inflamatorias y cánceres.
Comprender los mecanismos moleculares de la muerte celular a través de la activación de caspasas puede proporcionar información crítica sobre los procesos de la enfermedad. Julieann, investigadora postdoctoral asociada de un laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de aislar la médula ósea y diferenciar las DMO, infectar las células con el virus de la gripe A.
Calcule el volumen de virus necesario en una multiplicidad de infección de 20 unidades formadoras de placa. Retire los medios de los BMDM y lave las células una vez con 500 microlitros de PBS. Agregue 450 microlitros del virus de la influenza A en DMEM de alta glucosa sin FBS inactivado por calor a cada pocillo, e incube las placas a 37 grados centígrados durante una hora en una incubadora humidificada para permitir la absorción.
Al final de la incubación de una hora, agregue 50 microlitros de FBS inactivado por calor y devuelva las placas a la incubadora a 37 grados centígrados durante un total de 12 horas. Después de 12 horas de incubación, retire la placa de la incubadora. Aspire 150 microlitros del sobrenadante y deseche o guárdelo para el análisis del sobrenadante.
No retire el sobrenadante restante. Ahora, cree la solución de recolección de proteínas combinando 50 microlitros de tampón de lisis de caspasa y 100 microlitros de cuatro tampón XSDS por pocillo. Luego, agregue 150 microlitros de la mezcla a cada pozo.
Para cada pocillo, pipetear la mezcla para recoger las células lisadas y el sobrenadante. Durante el pipeteo, raspe el fondo del pozo con la punta de la pipeta para interrumpir las células. Después de raspar y pipetear, recoger el lisado de proteínas en tubos marcados de 1,5 mililitros.
Usando un bloque de calor, caliente todos los tubos a 100 grados centígrados durante 12 minutos. Retire los tubos del bloque térmico y centrifugar a 14, 500 G durante 30 segundos a temperatura ambiente para granular cualquier componente insoluble. Preparar el aparato de electroforesis con un gel de poliacrilamida al 12% con 10 pocillos.
Llene el aparato de electroforesis con un tampón de funcionamiento y retire el peine de gel. Luego, caliente las muestras a 100 grados centígrados durante cinco minutos. Centrifugar las muestras a 14, 500 G durante 30 segundos a temperatura ambiente antes de cargarlas.
Luego, cargue lentamente 30 microlitros de la muestra en cada pocillo. Utilice el sobrenadante combinado y el lisado de proteínas y el tampón de lisis de caspasa o el homogeneizado tisular para las manchas de caspasa 1, 3, 7 y 8, y use el tampón DN RIPA de lisado de proteínas descrito en el protocolo o el homogeneizado tisular para la caspasa 11 y 9. Para evaluar las seis caspasas a la vez, utilice el mismo procedimiento para cargar las mismas muestras en cada uno de los seis geles.
Conecte el aparato de electroforesis a la fuente de alimentación y ajuste la alimentación a 80 voltios durante 20 minutos para comenzar la carrera del gel. Después de los primeros 20 minutos, ajuste la potencia a 100 voltios durante 45 a 60 minutos. Observe el frente del tinte.
Una vez que el frente del tinte llegue al fondo del gel, apague la alimentación. Mientras el gel funciona, prepare el tampón de transferencia como se describe en el manuscrito. Haga que la solución sea fresca cada vez.
Retire el gel del aparato de electroforesis utilizando el liberador de gel. Para configurar la pila de transferencia para el gel, active una membrana de PVDF empapándola en metanol durante un minuto. Moje previamente dos trozos de papel de filtro, el gel y la membrana de PVDF y el tampón de transferencia durante cinco minutos.
Mantenga la membrana de PVDF y el gel en recipientes separados durante esta incubación de cinco minutos. Comience a ensamblar la pila de transferencia en el sistema semiseco. En el lado inferior nano de platino, coloque una pieza de papel de filtro, la membrana de PVDF, el gel y, finalmente, una pieza de papel de filtro.
Extienda suavemente o presione las burbujas de aire entre las capas y cierre la parte superior del sistema. Ahora, conéctese a la fuente de alimentación. Ajuste la alimentación a 25 voltios durante 40 minutos.
Después de la transferencia, desmonte la pila de transferencia, recoja la membrana y colóquela en una placa de Petri cuadrada. A continuación, realice el bloqueo de la membrana agregando 15 mililitros de una solución de leche descremada al 5% e incube la membrana en una coctelera oscilante a 50 a 70 RPM a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, retire la solución de bloqueo, agregue 10 mililitros de la solución de anticuerpos diluidos e incube durante dos horas a temperatura ambiente o cuatro grados centígrados durante la noche en una coctelera oscilante, como se demostró anteriormente.
Luego, recoja la solución de anticuerpos y lave la membrana agregando 15 mililitros de TBST a la membrana en un agitador oscilante a temperatura ambiente durante 10 minutos. Descarte el TBST. Repita el lavado con 15 mililitros de TBST tres veces.
Agregue 10 mililitros de la solución de anticuerpos conjugados HRP secundaria diluida. Incubar en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora. Al final de la incubación, una vez que se retire la solución de anticuerpos, lave la membrana agregando 15 mililitros de TBST en una coctelera a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de completar los pasos de lavado y retirar el TBST, agregue 10 mililitros del sustrato HRP de alta sensibilidad. Déjelo reposar a temperatura ambiente durante un minuto. Retire la membrana del sustrato.
Proceda directamente a la obtención de imágenes utilizando un generador de imágenes de quimioluminiscencia con la bandeja trans blanca accesoria insertada en la posición inferior. Exponga la membrana utilizando el modo de exposición automática. Se analizan las caspasa pro y activada 1, 11, 3, 7, 8 y 9 en tipo salvaje y mutante ZBP1 después de la infección por el virus de la influenza A, tipo salvaje y mutante AIM2 después de la infección por HSV1, e infección por Francisella novicida, o BDM mutantes de tipo salvaje y NLRP3 después de la estimulación con lipopolisacáridos y ATP.
Las células que carecen de sensores de PANoptosis aguas arriba no experimentan una muerte celular robusta en respuesta a los estímulos afines inductores de PANoptosis. La infección por el virus de la influenza A induce la formación del monosoma ZBP1-PANoptosoma y las células deficientes en ZBP1 están significativamente protegidas de la muerte celular durante la infección por el virus de la influenza A. Del mismo modo, las infecciones por HSV1 y Francisella novicida inducen la formación del PANoptosoma AIM2, y las células deficientes en AIM2 no experimentan una muerte celular robusta en respuesta a estas infecciones.
Las células que carecen de sensores inflamasómicos aguas arriba están protegidas de la muerte celular en respuesta a sus respectivos estímulos, y las células deficientes en NLRP3 no sufren muerte celular en respuesta al lipopolisacárido y al ATP. Es importante recordar preparar una mezcla de ambos lisados celulares para determinar una caspasa específica. Después de cargar el chorro, la muestra luminosa debe almacenarse menos 20 grados para mantener la integridad de los objetivos de la caspasa para el seguimiento Junto con este protocolo, se pueden usar imágenes de muerte celular en tiempo real o ensayos de LDH para monitorear la ejecución de la muerte celular, y ELIZA se puede usar para verificar la liberación de citoquinas o DAMP de células que experimentan diferentes tipos de muerte celular.
