Este es el primer protocolo de inyección de embriones para una especie de Chelicerata. La capacidad de inyectar embriones de garrapatas abrirá muchas líneas de investigación, en particular, estudios sobre la función del gen de la garrapata y las interacciones de patógenos de garrapatas. Esta técnica permite el trabajo futuro en estudios funcionales de genes de garrapatas y proporciona una base para el control de la población de garrapatas mediante el uso de sistemas de impulsores genéticos.
Este método facilitará la comprensión de la interacción entre las garrapatas y los patógenos que albergan a nivel molecular. Esto nos permitirá identificar proteínas que pueden usarse para el desarrollo de vacunas para la enfermedad de Lyme y otros patógenos. Mientras que varias áreas de investigación, como las interacciones de patógenos de garrapatas y la transmisión de patógenos a los huéspedes por garrapata durante la alimentación, se beneficiarán de este trabajo.
Preguntas más fundamentales, como cómo evaden las garrapatas la respuesta inmune del huésped, y las diferencias en los mecanismos de reparación del ADN también se pueden entender ahora. Hay algunos aspectos de la biología de las garrapatas que deben entenderse antes de llevar a cabo este procedimiento. La alta presión interna del embrión conduce a estallar cuando se toca con una aguja.
Es muy importante preparar los embriones para la inyección. Para comenzar, transfiera a las hembras de cuatro grados centígrados a una incubadora de 27 grados centígrados para el inicio de la puesta de huevos una semana antes de las inyecciones. Después de tres o cuatro días, cuando las hembras comiencen a poner huevos, retire los huevos con un pincel de punta fina mientras prepara a las hembras para la ablación de órganos de Gene.
Para vaciar la glándula, coloque la garrapata grávida en un portaobjetos de vidrio bajo un microscopio de manera que las partes de la boca sean visibles tanto en el lado ventral como en el dorsal. Luego perfore cuidadosamente el área detrás de las partes de la boca en el lado dorsal y aplique presión en el lado ventral con fórceps. Coloque el borde de una toallita sin pelusa y retire la cera líquida que sale del sitio de punción.
Alternativamente, en lugar de vaciar la glándula por disección, se pueden usar pegamentos como adhesivo tisular alrededor de las partes de la boca de la garrapata. Cuando las hembras comiencen a poner huevos nuevamente, use un pincel fino para recolectar los huevos recién depositados y colóquelos en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros. Agregue aproximadamente 200 microlitros de agua de cloruro de benzalconio al 5% en el tubo que contiene huevos de cero a 18 horas de edad.
Agite suavemente los huevos con el pincel durante cinco minutos para evitar que los huevos se depositen en el fondo del tubo, y retire el sobrenadante con una micropipeta, dejando los huevos en el tubo. Agregue aproximadamente 200 microlitros de agua destilada al tubo que contiene huevos. Revuelva con un pincel y retire el agua del tubo de microcentrífuga con una micropipeta.
Después de lavar con agua destilada, agregue aproximadamente 200 microlitros de cloruro de sodio al 5% y agite suavemente con un pincel durante cinco minutos. Luego, retire la solución del tubo después de cinco minutos y lave los huevos dos veces con agua destilada. A continuación, agregue aproximadamente 100 microlitros de solución de cloruro de sodio al 1% en el tubo de microcentrífuga que contiene huevos.
Primero, adhiera dos portaobjetos de microscopio de vidrio juntos, dejando un espacio de aproximadamente 0,5 centímetros para apoyar la alineación de los huevos con una cinta de doble cara, y aplique un trozo de apósito de película transparente en la cinta de doble cara en el espacio entre los portaobjetos. Luego alinee de ocho a 10 huevos a la vez en la configuración de la diapositiva con un pincel. Luego coloque el portaobjetos con huevos alineados en el escenario de un microscopio compuesto y retire la solución de cloruro de sodio al 1% con un trozo de toallita sin pelusa en la que se almacenan.
Conecte la aguja de inyección llena a un microinyector conectado a un micromanipulador. A continuación, abra la aguja frotándola suavemente contra la superficie del huevo utilizando un ajuste de alta presión en el microinyector. Después de abrir la aguja, reduzca la presión del microinyector dependiendo de la abertura de la aguja.
Luego inyecte todos los huevos en el portaobjetos en un ángulo de 10 a 15 grados lo más rápido posible, presione rápidamente el pedal e inmediatamente mueva el tobogán a condiciones de alta humedad en una placa de Petri con una toalla de papel húmeda. Después de cinco a seis horas de colocar el portaobjetos que contiene embriones inyectados en una placa de Petri grande forrada con papel de filtro húmedo, agregue una pequeña gota de agua destilada al aderezo de película transparente con embriones inyectados adheridos. Luego, desplaza suavemente los huevos con un pincel.
A continuación, transfiera los huevos a una pequeña placa de Petri y sumérjalos en agua destilada. Mantenga los huevos sumergidos en agua, coloque la placa de Petri en una caja de plástico de seis cuartos en una incubadora a 27 grados centígrados a más del 90% de humedad relativa. Cuando la larva comience a eclosionar de los embriones inyectados de 21 a 25 días después de la inyección, verifíquelos diariamente y transfiera las larvas eclosionadas a viales de vidrio con una pantalla en la parte superior.
Los resultados demostraron que inyectar los óvulos temprano en la embriogénesis de 12 a 18 horas de edad, y alinear el eje más largo del huevo perpendicular al borde de la diapositiva da como resultado una mayor tasa de supervivencia de los óvulos inyectados. De todos los huevos inyectados, hasta el 8,5% sobrevivieron y la larva eclosionó. Antes de comenzar este procedimiento, es importante recordar los pasos 2.4, eliminación de la cera de la garrapata madre, y los pasos 3.1 a 3.4, ablandamiento del corion del embrión con cloruro de benzalconio y desecación del embrión con soluciones de cloruro de sodio para permitir una inyección exitosa del embrión.
Este método fue desarrollado principalmente para la edición de genes de garrapatas, y esto nos permitirá hacer knockouts y knock-ins que nos ayudarán a comprender la función del gen de la garrapata. Esta técnica permitirá el uso de herramientas de edición de genes disponibles para muchos otros organismos que se aplicarán a la investigación de garrapatas. Y esto acelerará la investigación de la biología molecular de las garrapatas.
