Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales

Esta técnica puede obtener imágenes de mielina en secciones de tejido cerebral. La mielinización juega un papel importante en la conducción de los potenciales de acción y la comprensión de la mielina nos ayudará a comprender la función cerebral. La principal ventaja de la técnica CARS sobre, por ejemplo, la microscopía electrónica es que CARS es una técnica de microscopía óptica, y puede combinarse fácilmente con otras imágenes de fluorescencia, como las utilizadas en inmunohistoquímica.

Varias condiciones médicas se deben a alteraciones en la mielinización, por ejemplo, esclerosis múltiple, envejecimiento y autismo. Comprender estas alteraciones nos ayudará a comprender las condiciones médicas subyacentes. En este caso, el láser CARS está sintonizado para obtener imágenes de lípidos o, específicamente, enlaces CH2.

En el cerebro, la mayor fuente de lípidos es la mielina. Por lo tanto, esta es una técnica para obtener imágenes de la mielina en el tejido cerebral. Debería ser posible utilizar el mismo método para otros tipos de tejido cuando las imágenes de lípidos son de interés.

Ajustar y alinear el láser CARS requiere una experiencia significativa, y es mejor realizarlo un experto en láser o microscopía óptica. Después de preparar los tejidos como se describe en el manuscrito, tiñe las secciones flotantes para nisel y los medios de anticuerpos para visualizar los cuerpos celulares, luego incube las secciones en un agitador de laboratorio estándar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Antes de llevar las muestras al microscopio, encienda y caliente el láser CARS durante al menos una hora, luego alinee el láser CARS superponiendo espacialmente la bomba y los rayos láser, y ajuste el retardo entre los dos rayos láser.

Coloree la óptica del condensador y el diafragma del microscopio para obtener imágenes CARS hacia adelante, luego ajuste el periscopio externo para centrar los dos láseres superpuestos espacialmente en los espejos de la cabeza de escaneo del microscopio. Para la mejor detección de CARS no escaneados. Asegúrese de que el condensador sea atraído por el color.

Para la inmunofluorescencia, las imágenes confocales y las imágenes de automóviles, ajuste el láser CARS con detectores CARS no escaneados hacia adelante y epi incorporando un microscopio confocal equipado con láseres visibles para imágenes de fluorescencia. Ahora, coloque las secciones en un plato de cultivo con un fondo de cubreba, y PBS para evitar secar el tejido. Además, use un peso de vidrio para mantener el pañuelo cerca del cubierto.

Usando la interfaz gráfica de usuario, establezca los parámetros de adquisición de imágenes para automóviles e imágenes confocales de fluorescencia de misiles. Coloque la muestra en la plataforma del microscopio, enfoque la muestra y capture las imágenes. Los espectros de CARS varían de 640 a 660 nanómetros y no parece haber superposición en los espectros con el marcador inmunofluorescente marcado con nisel, lo que indica que las señales CARS se pueden usar con señales inmunofluorescentes.

Nisel se utilizó para visualizar los cuerpos celulares de los cerebros de jerbos y ratones de Mongolia, y las imágenes de CARS se utilizaron para visualizar la vaina de mielina, lo que indica que esta técnica podría usarse en todas las especies. Ambos conjuntos de imágenes muestran una sección del núcleo medial del cuerpo trapezoide en el tronco encefálico. La resolución de CARS es menor que con el microscopio electrónico y es del orden de varios cientos de nanómetros.

Las imágenes se pueden analizar con software de análisis de imágenes estándar, como ImageJ para cuantificar los parámetros de interés, por ejemplo, el grosor o la longitud de la mielina.