Este protocolo se puede utilizar para evaluar la integridad y plasticidad de una unión neuromuscular en condiciones normales y patológicas. Esta técnica consiste en etiquetar simultáneamente las células de Schwann y los animales de laboratorio pre y post en secciones musculares individuales. Después de sacrificar a la rata macho adulta, coloque la rata en la capucha y abra la cavidad torácica para acceder al corazón con tijeras y fórceps.
Inserte un catéter intravenoso desde el ventrículo cardíaco izquierdo hacia la aorta y corte el oráculo derecho. A continuación, comience la perfusión con 100 mililitros de solución salina normal al 0,9% hasta que la sangre que sale del oráculo derecho esté clara. Luego continúe perfundiendo con 250 a 300 mililitros de paraformaldehído al 4% en tampón de fosfato molar 0.1 o pH PB 7.4 durante 10 minutos.
Después de la perfusión, retire la piel de la extremidad posterior bilateral con una cuchilla quirúrgica y exponga el nervio ciático bilateral y el músculo gastrocnemio medial. Diseccionar el músculo gastrocnemio medial bilateral cuidadosamente de la extremidad posterior usando una cuchilla y colocar todo el músculo en 10 mililitros de paraformaldehído al 4%. Después de dos horas, retire el músculo de la solución y crioprotegalo en 10 mililitros de sacarosa al 25% en PB molar 0.1 durante un día a cuatro grados centígrados.
Una vez que el tejido muscular se sumerge en la solución de sacarosa, fíjelo en una etapa de congelación de un sistema de microtomo deslizante utilizando un medio de sección congelado. Corte el músculo horizontalmente a lo largo del eje largo del músculo con un grosor de 80 micras. Usando un cepillo, coloque siete secciones criogénicas por pozo de manera ordenada en una placa de cultivo de seis pozos con 10 mililitros de PB molar 0.1. Para la tinción fluorescente, incube cuatro secciones por pozo con 1,5 mililitros de PB molar 0,1 que contengan 75 microlitros de Tritón X 100 al 10% y 45 microlitros de suero de burro normal en un agitador orbital a 20 rpm.
Después de 30 minutos, transfiera las secciones a 1,5 mililitros de una solución mixta de anticuerpos primarios que contengan anti-filamento neuro de conejo 200, transportador de acetilcolina antivesicular de cabra en PB molar 0,1, en suero de burro normal al 1% y 0,5% Tritón X 100 e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave las secciones tres veces durante cinco minutos cada una en PB molar 0.1 en agitador orbital a 20 rpm. Después del último lavado, incubar la sección en una solución mixta de anticuerpos secundarios que contengan burro anti-conejo AF 488 y burro anti-cabra AF 546, así como los biomarcadores de toxina alfa bungaro AF 647 y faloidina 350 que contiene en 0.1 M PB que contiene 1% de suero de burro normal y 0.5 Tritón x 100 durante una hora, Protegiéndolos de la luz.
Después de la incubación, lave las secciones en PB y móntelas en un portaobjetos de microscopio. Aplique vidrio de cubierta en la sección con 50% de glicerina en agua destilada. Observe e imagine la muestra utilizando un sistema de imágenes focales equipado con una lente subjetiva de 20 x con una apertura numérica de 0,75 y una lente de 40 x con una apertura numérica de 0,95.
Para múltiples imágenes fluorescentes, establezca las longitudes de onda de excitación y emisión de cada biomarcador como se describe en el manuscrito de texto. Establezca la resolución de captura de imagen en 640 por 640 píxeles. A continuación, establezca el plano focal inicial y final.
Establezca el tamaño del paso en una o dos micras. A continuación, elija el patrón de profundidad, la captura de imágenes y la serie Z. Para las imágenes de menor aumento a 20 X, capture imágenes de pila de 40 Z en un tamaño de paso de dos micras utilizando un agujero de alfiler de 105 micras.
Elija el modo de proyección o topografía y la proyección de intensidad sobre el eje Z para integrar todas las imágenes en un solo enfoque. Para las imágenes de mayor aumento a 40 X, capture imágenes de pila de 80 Z en un tamaño de paso de micra con zoom establecido en dos y un agujero de alfiler de 105 micras. Integre todas las imágenes en un solo enfoque.
Reconstruya las imágenes en el patrón tridimensional con el sistema de procesamiento de imágenes. Aquí se demuestra la correlación espacial representativa del músculo gastrocnemio medial con el filamento neuro 200 fibras nerviosas positivas, el transportador vesicular de acetilcolina terminal presináptico positivo, los receptores de acetilcolina postsinápticos positivos para la toxina alfa bungaro, las células de Schwann perisinápticas S100 positivas, las fibras musculares positivas para faloidina y los núcleos celulares marcados con DAPI. El neurofilamento 200 fibras nerviosas positivas corrió en haz.
Estas fibras nerviosas dieron ramas a los terminales presinápticos positivos del transportador de acetilcolina vesicular, que formaron una relación espejo con los receptores de acetilcolina postsinápticos positivos de la toxina alfa bungaro. Además, las células de Schwann perisinápticas S100 positivas se detectaron alrededor del neurofilamento 200 fibras nerviosas positivas cerca de los terminales presinápticos. La correlación espacial se exhibió además en un patrón tridimensional que muestra las características morfológicas detalladas de la unión neuromuscular desde diferentes perspectivas.
Para observar más imágenes en las secciones musculares, es fundamental cortar el músculo horizontalmente a lo largo del eje largo a un grosor de 80 micras.
