Este método permite a los investigadores sondear sistemáticamente cómo las señales de la matriz afectan el fenotipo de las células en cultivo 3D. Demostramos el procedimiento utilizando cultivos de células GBM. La principal ventaja de esta técnica es la implementación de alto rendimiento, que nos permite filtrar muchas condiciones de matriz.
Esta técnica se puede utilizar para desarrollar matrices tisular-miméticas que preservan funciones específicas en modelos de cultivo celular, como la resistencia a los medicamentos de las células tumorales, y potencialmente identificar nuevas terapias. La demostración del procedimiento estará a cargo de Mary Epperson y Kelly Tamura, investigadoras de pregrado del Laboratorio Seidlits. Comience con la preparación de la solución tamponada con HEPES disolviendo el polvo de HEPES a 20 milimolares en la solución de sal equilibrada de Hanks.
Ajuste el pH a siete después de la sorbación completa. En la solución tamponada con HEPES, disuelva el HA tiolado de modo que del 6 al 8% de los residuos de ácido carboxílico en cada ácido glucurónico se modifiquen con un tiol a una concentración de 10 miligramos por mililitro en solución tampón. Revuelva a menos de 1.000 rotaciones por minuto utilizando una placa de agitación magnética a temperatura ambiente hasta que se disuelva por completo, generalmente alrededor de 45 minutos.
Mientras el HA se está disolviendo, prepare soluciones separadas de 100 miligramos por mililitro de 8 brazos peg norborneno, 100 miligramos por mililitro de tiol PEG de 4 brazos, cuatro milimolares de cisteína o péptido que contiene cisteína, y cuatro miligramos por mililitro de LAP en tubos de microcentrífuga. Prepare soluciones de cuatro milimolares de todos los péptidos para atarlos dentro de un solo hidrogel en este punto. Mezcle las soluciones individuales de HA, PEG norborneno, PEG tiol y péptidos que contienen cisteína-tiol para lograr las concentraciones finales para las matrices finales de hidrogel.
Revuelva a menos de 1.000 rotaciones por minuto en una placa de escalera magnética durante al menos 30 minutos para mezclar completamente. Alinee las muestras con el dispositivo de iluminación con cualquier otro LED en una sola columna de los moldes de silicona o placa de 384 pocillos. Abra los parámetros LED UV e introduzca valores de intensidad e iluminación.
Luego haga clic en Finalizar para comenzar la iluminación. Después de la iluminación, cuando se coloque en una esquina, mueva la placa del pozo a la siguiente esquina y repita. Para iluminar los pozos en la otra mitad de la placa, levante la placa del soporte y gire 180 grados.
Para generar hidrogeles con diferentes mecánicas, comience con la limpieza de los portaobjetos de vidrio y los moldes de silicona con cinta adhesiva para eliminar los escombros. Adhiera los moldes de silicona al portaobjetos de vidrio, presione hacia abajo para garantizar un buen sellado y desplace cualquier burbuja de aire. A continuación, pipetee 80 microlitros de solución precursora de hidrogel en cada molde de silicona en el portaobjetos de vidrio.
Coloque la corredera de vidrio sobre el dispositivo de iluminación alineado con cualquier otro LED en una sola columna. Exponga los precursores de hidrogel a la luz UV durante 15 segundos para el enlace cruzado de fotos. Una vez que la iluminación se haya detenido, recupere las diapositivas y afloje los geles de los moldes trazando la circunferencia interna del molde con una punta fina.
Retire los moldes de silicona con pinzas o fórceps. Llene una placa de 12 pocillos con dos mililitros de DPBS. Mueva los hidrogeles reticulados en la placa de pozo individual humedeciendo una espátula y empujándolos suavemente fuera del portaobjetos de vidrio.
Prepare las células deseadas como una solución de una sola célula. Recolecte los esferoides del glioblastoma, de aproximadamente 150 micrómetros de diámetro, de un cultivo de suspensión de matraz T-75 en un tubo cónico de 15 mililitros. Enjuague el matraz de cultivo con cinco mililitros de DPBS para eliminar las células y medios residuales y agregue este volumen al tubo cónico.
Centrifugar el tubo cónico que contiene células a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante con una pipeta serológica de cinco mililitros, teniendo cuidado de no perturbar el pellet celular y resuspenda en cinco mililitros de DPBS. Centrifugar a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente para lavar las células.
Aspire el sobrenadante con una pipeta serológica de cinco mililitros, teniendo cuidado de no perturbar el gránulo celular, y luego resuspenda las células en dos mililitros de reactivo de disociación celular. Incubar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Agregue tres mililitros de medio completo y pipetee suavemente de tres a cinco veces para descomponer los esferoides a una suspensión de una sola célula.
Centrifugar la suspensión de una sola celda a 400 veces G durante cinco minutos para granular las células a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante con una pipeta serológica de cinco mililitros, teniendo cuidado de no molestar el pellet celular. Resuspend las células en un mililitro de medio completo.
Extraiga una parte de las células para contar usando un hemocitómetro. Diluya esta porción dos veces con azul de tripano, que impregna las células con viabilidad comprometida. Cuente solo las células vivas e incoloras.
Determine el número de celdas necesarias para la encapsulación. Transfiera un volumen de medio que contenga el número total de células necesarias en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mililitros. Gire hacia abajo a 400 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Aspire el sobrenadante con una micropipeta, teniendo cuidado de no molestar la bolita celular. Resuspender el pellet celular en la solución precursora de hidrogel, mezclando bien mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta de 1.000 microlitros cuatro o cinco veces. Cargue las células en un conjunto de pipetas repetidos para dispensar 10 microlitros.
Para evitar burbujas y dispensación desigual, prepare el pipeteador repetido dispensando una o dos veces adicionales en un contenedor de desechos. En cada pocillo de una placa de 384 pocillos, dispense 10 microlitros de células suspendidas en solución de hidrogel del pipeteador repetido. Usando la matriz de LED, ilumine cada celda que contiene el pozo durante 15 segundos para lograr las propiedades mecánicas deseadas.
Agregue 40 microlitros de medios completos a cada pozo que contenga las células. Agregue 50 microlitros de DPBS a los pozos secos no experimentales que rodean los geles para minimizar las pérdidas debidas a la evaporación. Para las células de glioblastoma, agregue 40 microlitros del medicamento que contiene el medio para lograr la concentración final deseada, comenzando tres días después de la encapsulación.
Agregue 10 microlitros de reactivo CCK8 a cada pozo que contenga las células. Incubar durante una a cuatro horas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lea absorbancias a 450 nanómetros para todos los pozos después de la incubación.
El interrogatorio AFM de regiones a escala micrométrica en las superficies de hidrogeles individuales mostró que los hidrogeles con módulos de Young promedio más blandos también tenían rangos más pequeños de módulos que los hidrogeles más rígidos. Los cultivos 3D de células GS122 sembradas a densidades de 2, 500, 000 células por mililitro exhibieron viabilidades sustancialmente mayores cuando se evaluaron después de siete días en cultivo en comparación con las sembradas a densidades de 500, 000 células por mililitro. Las células GS122 mostraron ganancias de supervivencia en la condición de ocho kilopascales cuando se incluyeron péptidos derivados de osteopontina en la matriz, mientras que la incorporación de sialoproteína de unión a integrina o péptidos derivados de tenascina C proporcionaron beneficios mínimos de supervivencia, como cultivo y matrices con el péptido RGD de jengibre.
En contraste, ningún péptido confirió ganancias de supervivencia en la condición de cultivo de 0,8 kilopascales. Tanto las células GS122 como GS304 se propagan cuando se cultivan en matrices de hidrogel blandas o rígidas, incluidos los péptidos que contienen RGD. Las células GS122 muestran una falta similar de propagación en 0,8 y 8 kilopascales con osteopontina.
Sin embargo, GS122 solo mostró una mayor resistencia a la temozolomida en la condición de ocho kilopascales. Finalmente, esta plataforma de cultivo 3D miniaturizada se puede utilizar para cultivar células humanas de otros tipos de tumores, incluidos organoides viables de células de cáncer de próstata neuroendocrinas diferenciadas terminalmente. Después de este procedimiento, se pueden utilizar otras técnicas, como la secuenciación de ARN unicelular, para caracterizar aún más los fenotipos celulares.
