Este protocolo detalla todos los procedimientos experimentales, desde el etiquetado de epítopos de genes codificantes de factores de transcripción hasta el análisis computacional de datos, para realizar perfiles de todo el genoma de las interacciones de unión factor de transcripción-ADN en Candida albicans a través de CUT&RUN. Esta es una técnica más accesible, más rápida, más sensible, menos costosa y proporciona datos de mayor calidad que los enfoques tradicionales de chIP-chip y ChIP-seq. Aunque nuestro protocolo está desarrollado para células de Candida albicans aisladas de biopelículas o cultivos planctónicos, debería ser práctico adaptarlo a prácticamente cualquier buena forma de células de Candida albicans.
Después de incubar la suspensión celular, transfiera una alícuota de cinco microlitros a un nuevo tubo de PCR. A cinco microlitros de núcleos aislados y una alícuota de cinco microlitros de células intactas previamente almacenadas a cuatro grados Centígrados, agregue un microlitro cada uno de calcofluor-white y SYTO 13. Incubar a 30 grados centígrados en la oscuridad durante 30 minutos.
Inspeccione visualmente la integridad y pureza de los núcleos aislados utilizando un microscopio de fluorescencia. Busque núcleos aislados que muestren tinción prominente de SYTO 13 y asegúrese de que no haya tinción de la pared celular por el tinte blanco calcofluor. Repita la inspección con células intactas como control para la tinción de la pared celular con colorante blanco calcofluor.
Coloque los tubos en una rejilla magnética y espere hasta que la suspensión esté completamente clara. Deseche el sobrenadante con una pipeta. Agregue 50 microlitros del tampón de anticuerpos y mezcle suavemente mediante pipeteo.
Agregue tres microlitros del anticuerpo policlonal anti-GFP a los tubos e incube los tubos en un mezclador nutating a 4 grados Celsius durante dos horas. Centrifuga brevemente los tubos a 100 veces g a temperatura ambiente durante cinco segundos y coloca los tubos en un bastidor magnético. Una vez que la suspensión esté despejada, deseche el sobrenadante con una pipeta.
Mientras los tubos con las perlas todavía están en el bastidor magnético, agregue 200 microlitros de tampón de permeabilización de células heladas directamente sobre las cuentas. Deseche el sobrenadante con una pipeta. Repita dos lavados con el tampón de permeabilización de células heladas.
Agregue 50 microlitros de tampón de permeabilización de células heladas a cada tubo y mezcle suavemente mediante pipeteo. Añadir 2,5 microlitros de la proteína AG-MNasa a cada muestra y mezclar mediante pipeteo. Coloque las muestras en un mezclador de nutating a 4 grados centígrados e incube las muestras durante una hora.
Centrifugue brevemente los tubos de tira a 100 veces g a temperatura ambiente durante cinco segundos, luego coloque los tubos en un bastidor magnético. Una vez que la suspensión esté despejada, deseche el sobrenadante con una pipeta. Mientras los tubos con las perlas todavía están en el bastidor magnético, agregue 200 microlitros de tampón de permeabilización de células heladas directamente sobre las cuentas.
Deseche el sobrenadante con una pipeta. Repita dos lavados con el tampón de permeabilización de células heladas. Agregue 100 microlitros del tampón de permeabilización de células heladas a las muestras y pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces.
Retire el molde de gel de la caja de gel y abra el molde de gel según las instrucciones del fabricante. Retire suavemente el gel del molde de gel y colóquelo dentro de una bandeja de retención de gel que contenga 100 mililitros de TBE de una sola fuerza. Agregue 10 microlitros de la mancha de gel de ácido nucleico a la bandeja y gire suavemente.
Cubra con papel de aluminio para proteger de la luz e incube estáticamente a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego enjuague el gel dos veces con 100 mililitros de agua del grifo desionizada. Imagine el gel bajo iluminación de luz azul usando una cubierta de filtro ámbar.
Para cada biblioteca, corte el gel ligeramente por encima de la banda de dímero del adaptador prominente de aproximadamente 125 pares de bases y por debajo de la marca de la escalera del par de bases 400. Perfore la parte inferior de un tubo de 0,65 mililitros con una aguja de calibre 22 y coloque el tubo perforado dentro de un tubo de microfugio estéril de dos mililitros. Transfiera la rodaja de gel al tubo perforado dentro del tubo de microfugio de dos mililitros.
Centrifugar el tubo de microfugio de dos mililitros que contiene el tubo perforado de 0,65 mililitros y tomar una muestra a 10.000 veces g a temperatura ambiente durante dos minutos para recoger la suspensión de gel dentro del tubo de microfúfero de dos mililitros. Agregue 300 microlitros de tampón de elución de gel helado a la suspensión de gel. Mezcle en un nutator a temperatura ambiente durante un mínimo de tres horas o durante la noche.
Transfiera toda la suspensión de líquido y gel a una columna de filtro de 0,22 micrómetros y centrífuga a 10.000 veces g a temperatura ambiente durante un minuto. Descargue el código fuente para el análisis CUT&RUN desde la página de GitHub haciendo clic en el botón verde Código, seguido de la opción Descargar ZIP. Descomprima la carpeta en una ubicación relevante en el equipo local.
Instale Conda Environment y ejecútelo solo una vez. Una vez instalado Conda, cree un entorno virtual provisto del comando correspondiente. Active el entorno virtual cada vez que se ejecute este flujo de trabajo.
La digestión de la pared celular y la integridad nuclear se evaluaron visualizando tanto las células intactas de control como los núcleos aislados teñidos con la pared celular fluorescente y las tinciones de ácido nucleico. En contraste con los núcleos intactos aislados donde no se observa tinción de la pared celular, tanto los núcleos como las paredes celulares están marcados fluorescentemente en las células de control intactas. La figura muestra las bibliotecas CUT&RUN TF analizadas mediante un instrumento de electroforesis capilar.
Las bibliotecas CUT&RUN TF exitosas se enriquecen para fragmentos cortos de menos de 200 pares de bases. Las bibliotecas CUT&RUN TF subóptimas muestran enriquecimiento para fragmentos de ADN grandes. La figura aquí muestra que los motivos de unión al ADN Ndt80 se enriquecen en todos los loci unidos a Ndt80 identificados por CUT&RUN, lo que indica que los picos adicionales identificados por esta metodología son probablemente sitios unidos a Ndt80 de buena fe.
El análisis comparativo indicó que el protocolo CUT&RUN identificó la mayoría de los eventos de unión previamente conocidos para Ndt80 y Efg1 durante la formación de biopelículas. En general, tanto Ndt80 como Efg1 unidos a loci se superponen con los datos ChIP de precipitación inmune de cromatina publicados anteriormente y se identifican solo utilizando CUT&RUN. Nos permite aumentar significativamente el alcance y el ritmo de nuestra investigación centrada en las redes reguladoras transcripcionales y Candida albicans.
