Este protocolo ayuda a aislar la microglía de las lesiones de desmielinización microdiseccionadas del cerebro del ratón adulto para estudiar las características microgliales in vivo. Esta técnica ahorra tiempo y tiene requisitos más bajos tanto para los experimentadores como para los equipos. Este método ayuda a aislar la microglía del cerebro del animal, especialmente aquellos tejidos microdiseccionados en varios estados de enfermedad.
Comience por microdisectar las lesiones marcadas por tinte neutro alrededor del cuerpo calloso bajo un estereomicroscopio. Centrifugar el tejido disecado a 300 veces g durante 30 segundos para recoger la muestra en la parte inferior del tubo. Precalentar la mezcla de enzimas uno y mezclar la enzima de dos a 37 grados Celsius en una incubadora.
Luego, agregue 1, 950 microlitros de mezcla de enzimas precalentadas una a una muestra y digiera en una incubadora a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Agregue 30 microlitros de mezcla de enzimas precalentadas dos y mezcle suavemente. Después de la digestión, agregue cuatro mililitros de PBS frío al tubo y agite suavemente.
Centrifugar las muestras de tejido a 300 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y aspirar el sobrenadante lenta y completamente. Resuspend la célula gránulo suavemente con 1, 550 microlitros de PBS frío. Agregue 450 microlitros de la solución fría para la eliminación de escombros y mézclelos bien.
Use una pipeta de 1, 000 microlitros para superponer la mezcla muy lentamente y suavemente con dos mililitros de PBS frío. Centrifuga la mezcla y luego busca las tres capas. Use una pipeta de 1. 000 microlitros para aspirar completamente las dos capas superiores y llene el tubo hasta cinco mililitros con tampón de carga en frío.
Invierta suavemente el tubo tres veces. A continuación, después de la centrifugación y aspiración del sobrenadante, resuspenda el pellet celular con 90 microlitros de tampón de carga, y agregue 10 microlitros de perlas CD11b. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, agregue un mililitro del tampón de carga y lave las células canalizando suavemente el líquido hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1, 000 microlitros. Centrifugar las células a 300 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y aspirar el sobrenadante por completo para eliminar las perlas no unidas. Resuspender las celdas en 500 microlitros del búfer de carga, y colocar la columna MS con su separador para la selección positiva en el campo magnético.
Enjuague la columna con 500 microlitros del tampón de carga para proteger las células y garantizar la eficiencia de la clasificación magnética según el protocolo del fabricante. Aplique la suspensión celular sobre la columna MS y deseche el flujo que contiene las celdas no etiquetadas. Agregue 500 microlitros del búfer de carga para lavar la columna y retírela del separador.
Coloque la columna en un tubo centrífugo de 15 mililitros y agregue un mililitro del búfer de carga a la columna. Finalmente, empuje el émbolo hacia la parte inferior de la columna para eliminar las celdas marcadas magnéticamente. Aquí se muestra una representación esquemática de la estrategia de gating utilizada en el análisis de citometría de flujo de microglia aislada de lesiones de desmielinización de ratones adultos antes y después de la clasificación celular activada magnéticamente.
Las imágenes gráficas representan la altura de dispersión hacia adelante y la altura de dispersión lateral para seleccionar células, el área de dispersión hacia adelante y la altura de dispersión hacia adelante para seleccionar celdas individuales, y CD11b-FITC y CD45-APC para seleccionar las células mieloides y la microglía. La proporción de microglía ha aumentado significativamente después de la clasificación celular activada magnéticamente. La imagen gráfica representa la estrategia de cierre utilizada en el análisis de citometría de flujo para células individuales vivas y muertas después de la clasificación de células activadas magnéticamente.
Aquí, la 7-aminoactinomicina D y la altura de dispersión lateral se han utilizado para seleccionar las células vivas. Al intentar este procedimiento, recuerde microdiseccionar con precisión las lesiones desmielinizantes bajo un estereomicroscopio basado en las marcas rojas neutras.
