Este método puede ser útil en imágenes de toda la planta para revelar la morfología intacta, los procesos de desarrollo y las interacciones planta-microbio. La principal ventaja de esta técnica es que podemos observar directamente el interior de un cuerpo vegetal sin infligirle daño. Como este método se aplica a una amplia gama de especies y tejidos de plantas, puede ayudar a acelerar el descubrimiento de nuevos fenómenos en la investigación biológica de las plantas.
La fijación es un paso crítico en este procedimiento. Antes del paso de limpieza, uno necesita verificar la intensidad de la proteína fluorescente después de la fijación. Para comenzar a sumergir las muestras de la planta en la solución fijadora en un micro tubo, y asegúrese de que el volumen de la solución fijadora sea más de cinco veces el volumen de la muestra.
Selle el micro tubo con una película parafilm y haga agujeros con una aguja. Coloque el microtubo en un desecador y ajuste lentamente el grado de vacío a alrededor de 690 milímetros de mercurio para que las burbujas aparezcan gradualmente de las muestras. Apague la bomba de vacío después de evacuar el desecador.
Ventile el desecado con cuidado sin molestar las muestras. Vuelva a encender la bomba de vacío y apáguela después de evacuar el desecador. Abra el desecador con cuidado sin golpear la solución fijadora en el microtubo.
Retire la solución fijadora y agregue 1x PBS con una micro pipeta. Después de almacenar durante un minuto, reemplace el PBS antiguo con el nuevo PBS 1x. Después de eliminar el PBS a cinco veces el volumen de muestra de la solución de limpieza, selle el micro tubo con parafilm y haga agujeros con una aguja.
Coloque las muestras en el desecador. Evacue y apague la bomba de vacío. Abra el desecador suavemente, luego cierre el microtubo.
Invierta el microtubo, cada uno o dos días para acelerar el proceso de limpieza. Para el marco espaciador, corte una lámina de caucho de silicona con una cuchilla de afeitar ajustando el grosor de la hoja de caucho de silicona de acuerdo con el grosor de la muestra. Coloque el marco de silicona en un vidrio de cubierta, luego coloque las muestras tratadas dentro del marco y agregue alrededor de 100 microlitros de solución de limpieza para eliminar cualquier burbuja.
Cubra con otra cubierta de vidrio para evitar la evaporación de la solución de limpieza. Observe las muestras bajo un microscopio fluorescente. Después de la observación, devuelva las muestras a la solución de limpieza en un microtubo.
Las hojas fijas de varias especies se incubaron en PBS o ClearSee durante ocho días, en ClearSee o ClearSeeAlpha durante dos días. ClearSee puede limpiar hojas de varias especies. Después de extraer el cuticular, ClearSee podría limpiar las hojas de arroz.
Como el componente de sulfito de sodio en ClearSeeAlpha previene la oxidación de polifenoles debido al efecto reductor, ClearSeeAlpha podría eliminar los pistilos de tabaco y tirania sin pigmentación marrón. Las hojas promotoras de ubiquitina-10 H2B-mClover de arabidopsis thaliana se trataron con PBS o ClearSee durante tres días. El tratamiento ClearSee redujo el color verde pálido de la hoja de arabidopsis H2B-mClover y mejoró la intensidad de fluorescencia de H2B-mClover en comparación con la incubación de PBS.
Las hojas tratadas con ClearSee se observaron mediante microscopía de excitación de dos fotones con excitación de 950 nanómetros. La pared celular está teñida con calcaflour-blanco. Los núcleos están marcados con el promotor de ubiquitina-10, H2B-mClover.
Las imágenes Y Z y X Z son secciones transversales en la posición indicada por las líneas discontinuas blancas. La preparación de la solución fijadora es importante para fijar las muestras. Sin embargo, se debe tener cuidado para evitar daños a las muestras al vacío.
Se pueden realizar imágenes microscópicas para estudiar múltiples patrones de expresión génica y comunicaciones intracelulares durante el desarrollo de la planta y la infección después de este procedimiento.
