Hi.In este video aprenderá cómo realizar estudios de RM hiperpolarizada del corazón de ratón perfundido. David Shaul, un estudiante de MD / PhD en el laboratorio, lo guiará a través de las diversas técnicas y procedimientos. Hoy aprendemos un protocolo para estudiar el metabolismo hiperpolarizado del piruvato de carbono-13, combinado con la espectroscopia de RMN 31P.
El metabolismo del piruvato se encuentra en la encrucijada del metabolismo aeróbico y anaeróbico. Y como tal, es de gran valor para estudiar diversas condiciones del corazón. Entonces, comencemos.
El corazón del ratón se aísla y se perfunde con tampón Krebs-Hensleit, dentro de un tubo de RMN de 10 milímetros. Luego se inserta el corazón en el espectrómetro de RMN. Allí, se registra un espectro 31P para observar la energética cardíaca y el pH, mediante la observación de las resonancias de trifosfato de adenosina, fosfocreatina y fosfato inorgánico.
Mientras tanto, una muestra de piruvato que está marcada con carbono-13 en la primera posición está hiperpolarizada. Y después de que se produce la disolución, se inyecta en el corazón para permitir la medición de lactato, inorgánicos y piruvato de las actividades organizadas en tiempo real. Un día antes del experimento, prepare 400 mililitros de tampón Krebs-Henseleit modificado.
Como primer paso, resolvemos estos ingredientes en agua destilada doble. Luego, burbujee esta solución con esta mezcla de oxígeno durante 20 minutos y luego agregue cloruro de calcio. Ajuste el pH a 7.4.
El día del experimento, agregue glucosa e insulina. Ajuste el baño de agua a 40 grados centígrados. Inserte la botella mediana con 200 mililitros de tampón KH en el baño.
Utilice una bomba peristáltica para reciclar el tampón KH. Conéctese a él, una línea de entrada y dos líneas de salida. Inserte las líneas de entrada y salida en el tampón KH calentado.
Utilice un mezclador de oxígeno con 95% O2 y 5% CO2. Luego, inserte la línea de oxígeno en el tampón KH calentado. Encienda la bomba peristáltica y ajústela a un peso de flujo constante de 7,5 mililitros por minuto.
Queremos calibrar el sistema antes de introducir el corazón. Por lo tanto, inserte las líneas de entrada y salida en un tubo de RMN de 10 milímetros e inserte una sonda óptica de temperatura compatible con RMN. Inserte el tubo de RMN en el orificio del imán.
Ajuste el tanque de calefacción a 42 grados centígrados y use la calefacción por RMN para ajustar la temperatura dentro del imán a 37 grados centígrados. Tenga en cuenta que la temperatura de RMN se controla realmente en el tampón KH que se encuentra dentro del imán, utilizando un núcleo de temperatura compatible con RMN. Ahora, podemos usar la espectroscopia 31P para observar la señal de fosfato inorgánico dentro del tampón.
Este es el equipo que se requiere para el procedimiento quirúrgico. Coloque 100 mililitros de tampón KH en hielo y burbujee con la misma mezcla de oxígeno. Anestesiar al ratón dentro de la cámara de la caja con isoflurano al 3,3% mezclado con aire ambiente para la inducción, a un caudal de 340 mililitros por minuto.
Transfiera el ratón a anestesia nasal. Reducir a 2.9% isoflurano al mismo caudal. Pellizque el pie para verificar un reflejo negativo del dolor del pedal y que el ratón esté completamente anestesiado.
Inyecte al ratón con 300 unidades de heparina sódica, por vía intraperitoneal. Corte la piel dos centímetros por debajo del proceso xifoides. Corte la pared abdominal para exponer la cavidad abdominal.
Coloque la pinza de tijera entre el proceso xifoide y la piel del pecho, y úsela para retraer la pared torácica y exponer el diafragma. Perfore el lóbulo derecho del diafragma y luego corte el resto del diafragma. Corte a través de la línea media de la pared torácica evitando el contacto con órganos más profundos como el corazón y los vasos.
Inyecte 200 unidades de heparina sódica en el ventrículo izquierdo del corazón. Inyecte el corazón con 0,1 mililitros de 0,5 molares de KCL para lograr un paro cardíaco. Retraiga el tejido del timo anteriormente y córtelo de su raíz para exponer la aorta debajo de ella.
Trate de eliminar tanto tejido del timo como pueda mientras evita dañar la aorta. Retire el tejido residual de la caja torácica para permitir el paso libre del catéter intravenoso. Coloque las pinzas curvas debajo de la aorta y úselas para colocar un nudo de sutura de seda alrededor de la aorta.
Coloque fórceps curvos en la raíz aórtica y retraiga el corazón hacia abajo para exponer y estirar la aorta. Inyecte tres mililitros de tampón KH helado en el ventrículo izquierdo para eliminar los coágulos de sangre de la aorta y para preservar la viabilidad del corazón. Coloque varias gotas en la superficie del corazón también.
Use una aguja de catéter intravenoso para perforar la pared arterial de la aorta sin dañar la pared posterior. Luego, inserte el catéter con la aguja, unos tres milímetros. Luego, retire la aguja e inserte simultáneamente el tubo del catéter durante cinco milímetros adicionales, pero evite ingresar a la cámara del ventrículo izquierdo.
Coloque el adhesivo de cianoacrilato en la región de punción de la aorta, para evitar que el tubo del catéter se deslice fuera de la aorta mientras aprieta la sutura. Doble atar suavemente un nudo entre la aorta y el tubo de canulación . Inyecte cinco mililitros adicionales de tampón KH en el ventrículo izquierdo y verifique que fluya a través del tubo de canulación .
Esto marca que la canulación fue exitosa. Retire las pinzas curvas de la raíz aórtica. Desconecte el corazón de las vísceras circundantes evitando el contacto con el agente de canulación y con el tejido cardíaco.
Conecte inmediatamente la cánula a una jeringa tampón KH helada que fluya. Es importante evitar la introducción de burbujas de aire en el corazón. Eliminar el tejido no cardíaco.
En esta etapa, debe observar que el corazón vuelve a latir. Corte los bordes restantes de la sutura de seda. En la sala de RMN, desconecte la cánula de la jeringa y conéctela al tampón KH de 37 grados del sistema de perfusión.
Luego, inserte el corazón en el tubo de RMN de 10 milímetros. Coloque el corazón en el centro de la sonda y luego inserte el tubo de RMN con el corazón en el orificio del espectrómetro de RMN. Realice shim" usando la señal de agua en el canal 1H hasta que se logre un ancho de línea de 10 a 20 hercios.
Luego, adquiera espectros 31P del corazón utilizando un ángulo de giro de 50 grados y TR de 1.1 segundos en estado estacionario. Estas condiciones favorecen la señal de ATP, sobre las señales de PCr y fosfato inorgánico. Observar las señales de ATP y PCr, significa que el tejido es viable dentro del espectrómetro de RMN.
Utilice un programa de procesamiento dedicado para analizar los espectros. Realizar uperización exponencial de siete hercios. Use la corrección de línea de base y luego, asigne la señal de fosfocreatina a menos 2.5 ppm.
Observe las señales de fosfato inorgánico, fosfocreatina y ATP. Polarizar la muestra de piruvato, que se etiqueta en la primera posición con carbono 13, durante 80 minutos. Después de 80 minutos de polarización, la muestra está lista para la solución.
Así es como se produce la disolución. Inyecte el contenido de disolución en el corazón utilizando el enfoque de perfusión continua. Este enfoque fue diseñado para administrar el piruvato sin ninguna interrupción al nivel de perfusión y oxigenación del tejido.
El medio de solución que contiene el piruvato hiperpolarizado se inyecta a un tubo cónico, luego se inyecta manualmente a un bypass, y luego, dirigimos la perfusión a través del bypass, y el contenido de bypass fluye a través del corazón continuamente, y finalmente se lava. Utilizamos una tasa de perfusión de 7,5 mililitros por minuto y un volumen de derivación de 22 mililitros. Entonces, que los medios hiperpolarizados fluyen a través del corazón durante unos tres minutos.
En esta ventana de tiempo, utilizamos la espectroscopia de carbono 13 para medir las señales de piruvato, lactato y bicarbonato. Utilizamos un esquema de excitación que alterna entre excitación de lactato y excitación de bicarbonato, con intervalos de seis segundos. Utilizamos excitación selectiva saturante para adquirir la señal de carbono 13.
En este enfoque, el piruvato de sustrato se excita mínimamente, mientras que los metabolitos, lactato y bicarbonato, están completamente excitados. Observe y registre el metabolismo del piruvato de carbono 13 durante unos tres minutos. La investigación metabólica termina después de que la señal de piruvato decae.
Esta figura muestra espectros 31P registrados desde un corazón de ratón perfundido con tampón KH. El espectro adquirido del corazón, muestra las señales de alfa, beta y gamma ATP, PCr y Pi.La señal Pi se compone de dos componentes principales, El componente de la izquierda, que aparece en un campo superior, representa la señal Pi que se debe principalmente al tampón KH a un pH de 7.4. El borde y el componente menos homogéneo a la derecha, que está en un campo inferior, muestra la señal Pi que se encuentra en un ambiente más ácido.
Este componente surge del tejido cardíaco. A continuación, la señal Pi del tejido se obtuvo restando la señal Pi del búfer de toda la señal Pi. Luego se convirtió de una escala de ppm a una escala de pH.
El pH se investiga mediante un análisis multiparamétrico de la señal Pi tisular mediante el cálculo de la media ponderada, la mediana ponderada, el máximo global y la asimetría. Esta figura muestra el espectro típico de RMN de carbono 13, obtenido utilizando el enfoque de excitación de saturación selectiva de productos hiperpolarizados, durante la inyección de piruvato de carbono 13 hiperpolarizado en el corazón de ratón perfundido. Observe las señales de piruvato de lactato y bicarbonato.
La señal de piruvato se trunca aquí para fines mostrados. Los cambios en las intensidades de señal del sustrato y los metabolitos se deben a la relajación de T1, la frecuencia de excitación y las características del flujo. A continuación, se trazan las intensidades integradas de estas señales.
Además, trazamos en círculos negros, la intensidad integrada del piruvato que se recogió para la desintegración T1, y para el efecto de las excitaciones de frecuencia 4D, utilizando una constante de tiempo de decaimiento efectiva de 32 segundos. Se encontró que esta corrección produce la dinámica de flujo esperada para el sustrato. Lavado, meseta y lavado.
Usando este curso de tiempo de señal corregido, seleccionamos para su posterior análisis, la ventana de tiempo que se resalta en azul claro, en la que la concentración de piruvato en el tubo de RMN, fue constante y máxima. Las tasas de LDH y PDH se calcularon para cada uno de los puntos de tiempo seleccionados y luego se promediaron. Los valores principales para esta inyección se proporcionan en unidades de nanomoles por segundo.
En resumen, hemos mostrado el sistema experimental para realizar estudios metabólicos de piruvato hiperpolarizado en el corazón de ratón perfundido. Esperamos que esta información haya sido útil.
