Uso de crystal violet para mejorar la lectura basada en el efecto citopático visual para la valoración viral utilizando ensayos TCID50

El objetivo de este protocolo es producir una titulación de stock de virus y visualizarla utilizando la tinción violeta cristalina. Para hacer eso, se demostrará una titulación viral general seguida de la tinción. Esta titulación se realizará en una placa de 96 pocillos durante un período de siete días en un gabinete de bioseguridad dentro de un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad.

Para ello, se sembrará una placa de 96 pocillos de la línea celular preferida utilizando los medios correspondientes y se dejará crecer hasta que se confluya. El stock de virus será el diluido utilizando diluciones diez veces, mezclando 900 microlitros de medios y 100 microlitros de virus, o la dilución correspondiente. Asegúrese de vórtice cada tubo para garantizar la mezcla adecuada de los medios y el virus y evitar errores en las diluciones.

Escriba el diseño de su placa en el plomo, así como cada dilución para ayudar durante el proceso de infección. Antes de la infección, lavar con 200 microlitros de PBS. Agregue 50 microlitros de su inóculo en los pozos correspondientes.

Luego, incuba a 37 grados centígrados en una incubadora de 5% de CO2 durante siete días. Después de los siete días de incubación, lavar con 200 microlitros de PBS. Fije las células agregando 50 microlitros por pocillo de PFA al 4% en PBS e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, lave las células nuevamente dos veces con 200 microlitros de PBS antes de agregar 50 microlitros por pozo de cristal violeta en agua e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Finalmente, aspira cristal violeta de los pozos y opcionalmente, deja que las placas se sequen al aire durante dos a cinco minutos a temperatura ambiente o lávala con 200 microlitros de agua para eliminar las manchas excesivas antes de la visualización. Como resultado, después de volver a teñir, las células negativas se teñirán.

Se despejarán pozos positivos. Esta información se utilizará en una de las dos fórmulas descritas para calcular su título viral final. Cuando se comparó el título obtenido con cada método, se demostró que en la monocytoquímica la tinción podría en algunos casos detectar pozos positivos adicionales en comparación con el cristal violeta, y que asimismo, ambos métodos de tinción podrían detectar más pozos positivos que la evaluación visual mediante microscopía.