El protocolo ayuda a los estudiantes a identificar claramente las infecciones individuales y realizar el ensayo fácilmente, lo que hace que sea más eficiente cuantificar el título viral. Este protocolo incorpora un sencillo procedimiento de fijación y tinción que produce resultados fiables y reproducibles. Este método puede proporcionar información sobre la precisión y la eficacia de los tratamientos antivirales contra las enfermedades.
Los obstáculos más difíciles de este protocolo de plaquing son los recuentos de células para las placas de siembra, asegurándose de que las células no se abarroten, se sequen o se rayen durante todo el proceso. También se puede encontrar dificultad en la naturaleza meticulosa general de este protocolo. Sin embargo, la práctica es un importante contribuyente al éxito de este experimento.
Para comenzar, complete la dilución de la muestra en la adición de virus a las células en una sesión de laboratorio. Diluir en serie cada muestra de virus que se está placando en PBS. Por lo general, use diluciones de 10 veces para un seguimiento más preciso.
Mantenga todas las diluciones virales en hielo hasta que esté listo para agregar estas muestras de virus diluidas a las células. Retire el medio de cultivo celular de uno o dos pocillos con una pipeta. Agregue cuidadosamente la muestra de virus diluida gota a gota a cada monocapa de células gota a gota a través del lado de cada pozo.
Repita el proceso por cada uno o dos pocillos hasta que toda la placa se llene con las muestras de virus que se están placando. Mece suavemente todo el plato a mano. Luego incube la placa a 37 grados centígrados durante una hora para permitir la adsorción del virus.
Después de cada 10 minutos, retire la placa de la incubadora, vuelva a mecerla suavemente para propagar el virus de manera más uniforme a través de cada pozo y luego colóquela nuevamente en la incubadora. Para disminuir la posibilidad de contar inadvertidamente el inóculo no absorbido, retire la muestra de virus de los pozos utilizando una punta de pipeta de 1000 microlitros y deseche la muestra en un vaso de precipitados de desecho. Coloque 2.5 mililitros de una superposición de metilcelulosa en la placa y colóquela nuevamente en la incubadora.
Desinfecte el vaso de precipitados residual, generalmente con la adición de lejía, un yodóforo o un virucida similar, antes de retirarlo del gabinete de bioseguridad. Después de la incubación de dos días, retire la superposición de metilcelulosa de uno o dos pozos a la vez con una pipeta y colóquela en un vaso de precipitados de desecho. Agregue aproximadamente dos mililitros de violeta de cristal al 1% en etanol al 50% a cada pozo.
Incubar la placa con todos los pocillos llenos de la mancha durante 30 minutos a 37 grados centígrados. En este punto, desinfecte el vaso de precipitados residual como se demostró anteriormente. Lave las placas vigorosamente con agua del grifo hasta que la escorrentía esté clara.
Asegúrese de que haya diferencias de aproximadamente 10 veces en el número de placas en cada serie de dilución. La figura representa una disminución de 10 veces en los recuentos de placas donde el número contable de placas cayó en el rango de 10 a menos cuatro para las tres réplicas. Las tres primeras imágenes de la figura representan placas en la dilución de 10 a menos tres.
Sin embargo, la fila inferior muestra resultados cuando un ensayo de placa no se realiza bien. Hay muy pocas placas visibles de cualquier dilución en las áreas visibles alrededor de la parte superior donde las células Vero se han levantado completamente del sustrato. Del mismo modo, esta figura muestra problemas con las células que se secan o se manejan mal durante el ensayo de placa.
Sin embargo, esta cifra muestra críticamente una mala siembra de células Vero. Cada pozo muestra manchas púrpuras más oscuras, indicativas de células que no se extienden bien por el pozo y se apilan una encima de la otra en grupos. Para obtener los mejores resultados, asegúrese de que el virus se propague uniformemente a través de la placa para evitar placas agrupadas Los ensayos de placa son más efectivos que otros métodos cuantitativos porque solo cuentan el virus vivo.
De esa manera, se puede establecer una verdadera eficacia antiviral. Además, esta técnica nos ha permitido cuantificar la presencia viral en los fómites y explorar la efectividad de la administración de fármacos a partir de nuevos dispositivos médicos dentro de nuestro sector de investigación del virus del herpes.
