La exposición al estrés puede causar agregación de proteínas y provocar alteraciones significativas en el comportamiento fenotípico de las bacterias. El procedimiento descrito en este video permite la extracción y visualización de agregados de proteínas después del tratamiento de estrés. A diferencia de otros procedimientos publicados, este protocolo requiere un menor número de células y se abstiene de complicados procesos de interrupción física, así como de pasos de lavado e incubación que consumen mucho tiempo.
Este protocolo se puede utilizar para estudiar la agregación de proteínas en una amplia variedad de bacterias gramnegativas y grampositivas. También puede analizar el efecto de las deleciones de genes o comparar la eficacia de los compuestos proteotóxicos. Comience inoculando una sola colonia de cepa de E.coli MG1655 y cepa uropatógena de E.coli CFT073, cada una en cinco mililitros de caldo de lisogenia, o LB, medio.
Incubar los dos cultivos de caldo a 37 grados centígrados y 300 rpm durante 14 a 16 horas. Diluya cada cepa a una densidad óptica a 600 nanómetros, u OD600, de 0,1 en un matraz de 500 mililitros que contenga 70 mililitros de medio MOPS-g. Incubar los matraces a 37 grados y 300 rpm hasta que se alcance la fase logarítrica media.
Después de la incubación, transfiera 20 mililitros de cada cultivo a tres matraces precalentados de 125 mililitros e incube a 37 grados Celsius y 300 rpm durante dos minutos. Prepare una solución compuesta antimicrobiana de dos miligramos por mililitro en medio MOPS-g. Agregue esta solución a cada cultivo para alcanzar las concentraciones deseadas y agregue el volumen requerido de medio MOPS-g para el control no tratado.
Determinar el OD600 de cada cultivo después de 45 minutos de tratamiento de estrés. Para cada muestra, alícuota cuatro mililitros de cultivo con un OD600 de uno en tubos de centrífuga de 15 mililitros. Resuspend los gránulos celulares en 50 microlitros de tampón de lisis helado.
Incubar las muestras durante 30 minutos sobre hielo. Agregue 360 microlitros de tampón A helado a las muestras y mezcle suavemente mediante pipeteo. Transfiera las muestras a tubos de microcentrífuga de dos mililitros con alrededor de 200 microlitros de perlas de vidrio de 0,5 milímetros.
Incubar los tubos durante 30 minutos a ocho grados centígrados en un ThermoMixer con agitación a 1400 rpm. Incubar los tubos en hielo durante cinco minutos sin agitar para asentar las perlas de vidrio. Luego transfiera 200 microlitros del lisato celular a tubos de microcentrífuga de 1.7 mililitros.
Centrifugar el lisado celular durante 20 minutos a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante, que se utilizará como muestra de proteína soluble más adelante. Use una pipeta para resuspender el pellet en 200 microlitros de tampón helado A.Centrifugación de los tubos a 16, 000 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.
Luego retire cuidadosamente el sobrenadante por completo. Use una pipeta para resuspender cuidadosamente el pellet en 200 microlitros de tampón helado B.Centrifugar los tubos nuevamente y retire cuidadosamente el sobrenadante. Luego repita el lavado con el tampón A.Vuelva a gastar el pellet en 100 microlitros de tampón de muestra SDS reductor 1x, y hierva durante cinco minutos en un ThermoMixer a 95 grados centígrados.
Mezcle un volumen de 100% TCA con cuatro volúmenes de la muestra de proteína soluble recolectada anteriormente, e incube durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para la precipitación de proteínas. Centrifugar la muestra a 21.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos para obtener el precipitado, y retirar el sobrenadante. Use 200 microlitros de acetona helada para lavar el pellet, para eliminar los desechos celulares.
Centrifugar la muestra de nuevo para obtener el precipitado, y retirar el sobrenadante. Para eliminar la acetona restante de los gránulos, mantenga los tubos de la microcentrífuga en el ThermoMixer a 37 grados centígrados con las tapas abiertas. Luego agregue 100 microlitros de tampón SDS reductor 1x para disolver completamente el pellet y hierva la muestra a 95 grados Celsius durante cinco minutos.
Cargue inmediatamente la muestra en un gel de poliacrilamida SDS para su separación, o almacene la muestra a menos 20 grados centígrados para continuar más tarde. Prepare dos geles separadores como se describe en el manuscrito de texto. Vierta el gel entre las placas de vidrio con una pipeta de un mililitro, asegurándose de que los dos centímetros superiores estén libres de la mezcla.
Agregue 70% de etanol sobre el gel separador, creando una interfaz uniforme entre las dos capas. Una vez que los geles de separación se hayan polimerizado, prepare los geles de apilamiento utilizando las instrucciones del manuscrito de texto. Luego retire el etanol de los geles de separación y agregue la solución de gel de apilamiento.
Inserte cuidadosamente un peine con el número deseado de bolsillos sin introducir burbujas de aire, y deje que el gel polimerice durante 20 a 30 minutos. Cargue cuatro microlitros de cada muestra, así como la escalera de proteínas, en pozos separados. Luego ejecute el gel en tampón de tris-glicina a 144 voltios durante 45 minutos a temperatura ambiente.
Use la solución A de Fairbanks precalentada para teñir los geles en un balancín durante 30 minutos y la solución D de Fairbanks precalentada para decolorar los geles en un balancín hasta que se logre el fondo deseado. Se observó un aumento en la cantidad de agregado de proteínas formado cuando las células fueron tratadas con 175 microgramos por mililitro y 200 microgramos por mililitro del antimicrobiano, en comparación con las células no tratadas. El aumento en la fracción de proteína insoluble fue más pronunciado en la cepa MG1655 más sensible.
Se observó una disminución en la cantidad de proteínas solubles cuando las células fueron tratadas con 175 microgramos por mililitro y 200 microgramos por mililitro del antimicrobiano, en comparación con las células no tratadas. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que la normalización a la densidad óptica a 600 nanómetros es importante para la comparación del alcance de la agregación de proteínas en las muestras.
