La degeneración del disco intervertebral conduce a un alto grado de deterioro y dolor. Nuestro protocolo nos permite investigar morfológicamente el desarrollo del disco y sus cambios en la degeneración. La red de colágeno denso tipo uno hace que generalmente sea difícil analizar el disco intervertebral por microscopía.
Con la seccionamiento óptico, podemos investigar la disposición 3D de los condrocitos dentro de los diferentes tejidos. Comience colocando muestras de disco intervertebral o IVD obtenidas intraoperatoriamente en DMEM suplementadas con 2% volumen por volumen Penicilina-Estreptomicina y 1.2% volumen por volumen Anfotericina B, inmediatamente después de la recolección, almacene muestras de IVD a cuatro grados Celsius hasta su procesamiento posterior. Si se congela, descongele las muestras de IVD humanas a temperatura ambiente e identifique el origen del tejido de IVD humano en función de las propiedades microscópicas tales como; densidad y orientación universitarias.
Para recolectar el tejido del disco bovino, tome el segmento de movimiento que consiste en el IVD con sus dos vértebras adyacentes y, utilizando una cuchilla quirúrgica número 15, diseccione todo el disco bovino del hueso subcondral, voltee el disco para llegar a las áreas centradas. Después de identificar las diferentes áreas del cartílago, use una cuchilla quirúrgica número 20 o 22 para cortar el área de interés de todo el disco. Los IVD de embriones bovinos con una longitud de corona-grupa inferior a 20 centímetros deben procesarse sin disección.
Se realizó la descalcificación del tejido como se describe en el manuscrito. Confirme la descalcificación exitosa, si una aguja de calibre 20 penetra en el tejido del disco, o si corresponde en las vértebras sin resistencia notable. Exacta las muestras de tejido en el volumen diez veces mayor de solución de formaldehído al 4% en PBS durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, coloque el tejido en un medio de incrustación soluble en agua en la perilla del criotomo, de modo que normalmente se genere un plano axial o un plano que corte perpendicularmente el colágeno tipo uno. Utilice el criotomo estándar para seccionar el tejido incrustado a un grosor de 70 micrómetros en muestras humanas y 40 micrómetros en muestras bovinas. Recoja las secciones en un portaobjetos de vidrio antes de enjuagar las secciones tres veces con PBS, agregue un tinte fluorescente adecuado seguido del medio de montaje y cubra las secciones con un resbalón de cubierta.
Coloque una diapositiva con una sección de tejido de tinción en el soporte de muestra del microscopio de florescencia iniciando el dispositivo de iluminación de la estructura para realizar imágenes de un solo campo de visión con filtros fluorescentes e iluminación adecuada. Utilizando un software de optimización de imágenes compatible con el microscopio de florescencia, procese las imágenes optimizando la intensidad y el brillo. Para visualizar la sección en su conjunto, utilice la técnica de imagen de mosaico abriendo la configuración de adquisición de 60 desde el panel de la barra de herramientas y ajustando la configuración de mosaico en el registro de mosaicos.
Para ello, defina el número de columnas y filas de imágenes de campo de visión que luego se fusionarán en una imagen general, presione configuración y ajuste la corrección de enfoque de mosaicos individuales. Post-procesar las imágenes optimizando la intensidad y el brillo. Para analizar la organización espacial de los condrocitos, utilice la función 3D incorporada en el software ajustando la configuración de la pila Z con el botón de inicio / parada, defina los parámetros de escaneo como las posiciones de inicio y parada en el eje Z y la distancia de corte.
Identifique patrones celulares individuales y use un complemento de recuento de células para el análisis cuantitativo de los patrones celulares, calcule la densidad celular dividiendo las células contadas por el tamaño de la región de interés elegida. La arquitectura del IVD con su densa red de fibras de colágeno en el anillo y el núcleo más blando se puede reconocer en las imágenes de mosaico tomadas en el plano axial y sagital. En áreas ampliadas de las imágenes de mosaico, se observaron diferentes patrones organizativos espaciales de condrocitos como; células individuales, pares y cuerdas.
El estudio de las diferentes etapas de desarrollo y maduración de la fibrosis anular bovina mostró una disminución continua de la densidad celular durante el desarrollo del disco embrionario. Por otro lado, se observó un aumento de la densidad celular y la formación de grupos en el disco humano adulto durante la degeneración. La densidad celular en las primeras etapas del desarrollo de ivD en la fibrosis del anillo bovino y el núcleo pulposo bovino disminuyó rápidamente hasta el nacimiento.
Mediante imágenes de canal del IVD con el Epítome permitió visualizar la arquitectura 3D de los patrones espaciales como el citoplasma y el núcleo, en el IVD intacto único así como se detectaron pares de condrocitos. Mientras que en el anillo degenerado se encontraron grupos de células. La parte más desafiante es asignar el tejido a su origen y corregir el incrustado para la sección.
Esto es esencial para obtener resultados confiables. Tener correctamente diseccionado y seleccionado el tejido IVD de diferentes etapas y orígenes nos permite profundizar en el análisis mediante análisis bioquímicos y biomecánicos adicionales, como el ELISA o la microscopía de fuerza atómica.
