Este método se puede realizar en cualquier laboratorio equipado para experimentos de cultivo celular. Usando este método, podemos ampliar nuestra comprensión del desarrollo renal y las vías de la enfermedad. Este es un método relativamente simple y económico en comparación con otros para generar organoides renales.
El mayor desafío de esta técnica es mantener un cultivo de células madre pluripotentes humanas de alta calidad. Es fundamental que las células se mantengan a menos del 80% de confluencia y se dividan regularmente. Los investigadores nuevos en el cultivo de células madre pluripotentes humanas deben familiarizarse con las líneas de células madre antes de proceder a la diferenciación.
Comience el ensayo de organoides renales agregando dos mililitros de medio E5-ILP completo en cada pozo de una placa de fijación ultra baja de seis pocillos. Cultive células madre pluripotentes humanas, o hPSC, en placas tratadas con cultivo de tejidos de 100 milímetros hasta que alcancen el 60% de confluencia. Lave las hPSC dos veces con aproximadamente ocho mililitros de DPBS.
Aspire el DPBS, luego agregue dos mililitros de Dispase gota a gota para cubrir las células e incube durante seis minutos a 37 grados centígrados. Lave las células tres veces con aproximadamente 10 mililitros de DPBS. Aspire el DPBS, luego incline la placa 45 grados y raspe las celdas hacia abajo con un elevador de células.
Lave las colonias desde la parte superior con seis mililitros de medio E5-ILP completo utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros. Luego, sosteniendo la pipeta verticalmente, rompa las colonias grandes canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo, teniendo cuidado de no tocar los lados de la placa de cultivo. Distribuya los grupos de colonias de manera uniforme agregando un mililitro por pozo en la placa de seis pocillos, luego coloque la placa en un agitador orbital dentro de una incubadora de 37 grados Celsius.
Alternativamente, si no se dispone de un agitador orbital, las células se pueden cultivar estáticamente. En el segundo día, después de dejar que los cuerpos embrionarios se asienten en la parte inferior de la placa, incline la placa en 45 grados y aspire el medio lentamente desde la parte superior, dejando un mililitro por pozo. Agregue dos mililitros de medio completo preparado por pozo y devuelva la placa al agitador.
En el tercer día, después de aspirar el medio como se demostró anteriormente, recoja todos los cuerpos embrioides cuidadosamente de cada pozo utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros y transfiéralos a un tubo cónico de 50 mililitros. Para recolectar cualquier cuerpo embrionario restante, enjuague cada pozo con un mililitro de DMEM bajo en glucosa y agréguelos al mismo tubo cónico de 50 mililitros. Mientras espera a que los cuerpos embrionarios se asienten en la parte inferior del tubo, agregue dos mililitros de medio de Etapa II a cada pozo de la placa de seis pocillos.
A continuación, tamice grandes cuerpos embrionarios colocando un colador celular de 200 micrómetros sobre un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y pipeteando todos los cuerpos embrionarios cuidadosamente sobre el colador celular. Enjuague el colador celular con cinco mililitros adicionales de DMEM para recolectar cualquier cuerpo embrionario atascado en el colador. En etapas posteriores, primero use un colador de 500 micrómetros para tamizar cuerpos embrionarios muy grandes, luego pase el filtrado a través de un colador de 200 micrómetros para tamizar cuerpos embrionarios muy pequeños sin túbulos.
Recolecte los cuerpos embrionarios del tamaño correcto, entre 200 y 500 micrómetros, invirtiendo el colador de 200 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros y lavando el colador con DPBS. Después del esfuerzo, permita que los cuerpos embrionarios se asienten en el fondo del tubo cónico, luego aspire el sobrenadante y lave con aproximadamente 10 mililitros de DMEM. Luego, resuspenda los cuerpos embrioides en seis mililitros de medio de Etapa II.
Transfiera los cuerpos embrionarios de nuevo a la placa de fijación ultra baja de seis pocillos, distribuyéndolos uniformemente entre los pozos. Dado que la mayoría de los organoides se acumulan en la parte superior de la pipeta, deje aproximadamente medio mililitro al final, luego toque suavemente la punta del medio en cada pozo, permitiendo que los organoides fluyan hacia el pozo. Transfiera los cuerpos embrionarios a un matraz giratorio de 125 mililitros con 45 mililitros de medio de etapa II.
Ajuste la velocidad de agitación magnética a 120 rpm y coloque el matraz en la incubadora. Para alimentar los cuerpos embrioides u organoides renales, déjelos asentarse brevemente en la parte inferior del matraz giratorio, luego levante la tapa de un brazo lateral del matraz y coloque la pipeta aspiradora en el interior con la punta tocando la pared interior opuesta. Incline lentamente la pipeta hacia abajo y aspire aproximadamente la mitad del medio.
Reponga con 20 mililitros de medio fresco de Etapa II pipeteándolo a través de la misma abertura. Use fórceps estériles largos para colocar cuidadosamente una barra de agitación magnética en cada pozo de una placa de seis pocillos con cuerpos embrionarios u organoides renales. Coloque la placa en la placa de agitación magnética de seis ruedas y ajuste la velocidad a 120 rpm.
Para que las barras de agitación magnéticas encajen en su posición y comiencen a girar, primero ajuste el nivel de potencia a 100. Una vez que todas las barras comiencen a girar, baje el nivel de potencia a 25. Mantenga los organoides renales cambiando la mitad del medio como se demostró anteriormente.
La inmunofluorescencia de las secciones de parafina de los organoides renales del día 14 muestran la presencia de segmentos de nefrona como los túbulos renales que expresan factor nuclear de hepatocitos-1 beta y lectina de Lotus tetragonolobus, así como grupos de podocitos que expresan V-maf fibrosarcoma musculoaponeurótico homólogo de oncogén B y nefrina. Las modificaciones en este protocolo pueden apoyar la expansión de las células endoteliales, como se confirma mediante la tinción con plaquetas y molécula de adhesión celular endotelial-1 en el día 26 de cultivo. Las células madre pluripotentes humanas deben tratarse con Dispase durante el tiempo adecuado, luego lavarse a fondo para eliminar todos los rastros.
Si dispasa no se elimina por completo, puede conducir a la muerte celular y la agrupación de cuerpos embrioides. Este método nos ha ayudado a examinar el desarrollo de enfermedades renales congénitas, así como varias vías de lesión renal y el potencial de intervenciones terapéuticas in vitro.
