El análisis crio-EM de una sola partícula se ha convertido en una técnica rutinaria en la caja de herramientas del biólogo estructural aplicable a una amplia gama de especímenes, incluidas proteínas de membrana, fibrillas amiloides, proteínas de unión a ácidos nucleicos y virus. Una vez que se ha completado la preparación de la muestra y las rejillas cargadas en el microscopio, la recopilación de datos se puede llevar a cabo de forma remota en muchas instalaciones de crio-EM, como el Laboratorio de Bioestructura de Astbury y eBIC. Las principales barreras para la determinación exitosa de la estructura a menudo se encuentran en las etapas de preparación de la muestra y selección de la cuadrícula con múltiples iteraciones que a veces se requieren a través de este proceso.
Aquí, demostraremos la detección remota de la red y la adquisición de datos de una sola partícula. En la pestaña cargador automático de la interfaz de usuario del microscopio, elimine el cuadro de diálogo de opciones con la flecha y presione el botón de inventario. Esto verificará secuencialmente cada posición en el cassette para determinar si hay un cartucho presente.
El inventario se ejecutará en cada ranura secuencialmente. Cuando se mapeen todas las ranuras ocupadas, el inventario se detendrá. Resalte la rejilla que se va a transferir a la columna del microscopio y haga clic en cargar.
La etiqueta de la ranura cambiará de azul a amarillo una vez que la cuadrícula se haya cargado correctamente en el escenario. Para filtrar las cuadrículas, abra el software EPU. En la página de preparación, seleccione la óptica y la configuración de adquisición y, a continuación, seleccione el ajuste preestablecido del atlas en el menú desplegable.
Elija los ajustes preestablecidos de ajuste de haz adecuados y presione set para empujar los parámetros al microscopio. Presione para abrir las válvulas de la columna e inserte la pantalla contra la gripe. Compruebe que un haz es visible y está lo suficientemente extendido y centrado para cubrir el detector.
Si es necesario, navegue a una región más delgada de la cuadrícula usando el joystick o los paneles de mano virtuales para controlar los movimientos del escenario en X e Y.Levante la pantalla de la gripe y tome una imagen usando el botón de vista previa en EPU. En EPU, vaya a la página del atlas y presione nueva sesión. Seleccione el formato de imagen MRC e introduzca un nombre de carpeta y una ubicación adecuados para guardar la sesión de selección y, a continuación, haga clic en Aplicar.
Seleccione la selección en el menú de la izquierda. Marque las casillas de verificación junto a cada cuadrícula para adquirir un montaje de atlas, luego inicie la sesión de proyección en EPU. Se adquiere un atlas para cada cuadrícula verificada y los cuadrados de cuadrícula disponibles se enumeran al finalizar.
Cada atlas se puede ver resaltándolo en la página de proyección. Cuando haya terminado, revise los atlas recolectados e identifique las cuadrículas adecuadas para evaluar la calidad de la muestra a aumentos más altos. Resalte la cuadrícula elegida en el menú de detección de EPU y haga clic en cargar muestra.
En el menú de selección del atlas, seleccione la cuadrícula actualmente cargada y mueva el escenario a un cuadrado de cuadrícula que contenga los agujeros rellenos haciendo clic con el botón derecho sobre la ubicación deseada en la imagen de la cuadrícula y seleccionando mover etapa aquí. Vuelva a la página de preparación de EPU y seleccione el ajuste preestablecido de cuadrado de cuadrícula. Abra la página de funciones automáticas de EPU y ejecute la inclinación auto-eucéntrica por etapa con el ajuste preestablecido de cuadrado de cuadrícula para mover la muestra a la altura eucéntrica.
En la preparación de EPU, tome una nueva imagen de vista previa de cuadrado de cuadrícula. Tenga en cuenta los valores de gris en diferentes orificios que indican diferentes espesores de hielo. Mueva el escenario sobre un agujero haciendo clic con el botón derecho y mueva el escenario aquí.
Seleccione el taladro o el ajuste preestablecido de altura eucéntrica y, a continuación, haga clic en vista previa. Seleccione el ajuste preestablecido de adquisición de datos y establezca un aumento que permita una fácil identificación de las partículas. Ajuste el desplazamiento de desenfoque a negativo de tres a cinco micrómetros.
Repita los pasos para reevaluar un rango de espesor de hielo para la distribución, orientación y contaminación de partículas en toda la red. Dependiendo de la disponibilidad del microscopio, continúe directamente con la recopilación de datos o las rejillas se pueden quitar del microscopio para su futura recolección, incluso en otros sitios. Recopile un atlas si no está disponible desde la selección configurando la configuración del atlas y seleccionando la cuadrícula para adquirir el atlas.
Adquiera atlas y haga clic en la ubicación de la cuadrícula para ver la salida. Una vez que el atlas esté completo, defina cada uno de los ajustes preestablecidos de ajuste de haz de acuerdo con las necesidades experimentales del proyecto. Realice calibraciones de cambio de imagen.
Configure la sesión de EPU seleccionando la configuración de sesión de página de EPU y, a continuación, seleccionando nueva sesión o nueva de las preferencias. Después de seleccionar la nueva sesión, aparecerá una ventana emergente que proporciona una opción para usar la configuración anterior. La configuración se cargará automáticamente desde la sesión anterior a la actual de la EPU.
Alternativamente, seleccione nuevo de las preferencias y elija un archivo con preferencias guardadas para precargar esta información en la EPU actual. Rellene el nombre de la sesión con algo informativo. En tipo, seleccione manual.
Para el modo de adquisición, seleccione un centrado preciso del orificio o una adquisición más rápida si la colección de desplazamiento de imagen sin aberraciones está disponible y se desea. Seleccione el formato de imagen deseado, luego seleccione la carpeta de almacenamiento y EPU creará un directorio con el nombre de la sesión. Seleccione la cuadrícula adecuada según la separación entre orificios de la cuadrícula que se esté utilizando y pulse aplicar.
Seleccione un cuadrado de cuadrícula inicial y establezca una plantilla de adquisición. Vaya a la selección cuadrada. Si todos los cuadrados son verdes, haga clic en anular la selección de todos en la parte superior izquierda.
Para abrir iconos, haga clic con el botón secundario y, a continuación, seleccione Abrir icono. Agregue o elija un cuadrado de cuadrícula haciendo clic en seleccionar, luego haga clic con el botón derecho y seleccione mover etapa a cuadrado de cuadrícula. Vaya a la selección de taladros y pulse auto-eucentric.
Espere hasta que se tome una imagen cuadrada de cuadrícula. Si la función automática falla, esto puede deberse a que la altura está significativamente desactivada. Se puede ajustar manualmente utilizando la pantalla contra la gripe con un aumento cuadrado de cuadrícula.
Para medir el tamaño del agujero, mueva y ajuste los círculos amarillos para que estén sobre los orificios con el tamaño y el espaciado correctos. Presione buscar agujeros. Compruebe que los agujeros se han encontrado correctamente.
De lo contrario, cambie el tamaño del orificio y presione buscar orificios nuevamente. Si este proceso falla constantemente, considere pasar a un número más bajo o a un tamaño de punto más brillante con un aumento cuadrado de cuadrícula. Utilice el histograma de calidad de hielo del filtro a la derecha para ajustar la selección del orificio.
Esto puede ser útil para excluir áreas con hielo grueso y hielo delgado. Esto se recordará para los futuros cuadrados de cuadrícula seleccionados durante la sesión. Optimice la selección de taladros con las herramientas del menú de selección de la parte superior.
Por ejemplo, haga clic en quitar taladros cerca de la barra de cuadrícula. Vaya a definición de plantilla y presione adquirir. Haga clic en Buscar y centrar el agujero.
Cambie el retardo después del cambio de etapa y el retraso después de los tiempos de cambio de imagen a uno a cinco segundos, luego, si está disponible, verifique que el valor máximo de desplazamiento de imagen sea el deseado. Haga clic en agregar área de adquisición y haga clic en cualquier lugar de la imagen. Mueva el área de adquisición a la ubicación deseada.
Añade el rango de desenfoque en la parte superior derecha. Una lista típica de desenfoque para un proyecto de proteína de membrana es un desenfoque negativo de 0.8 a tres micrómetros negativo, luego agregue otras áreas de adquisición, disponiéndolas de tal manera que las áreas de adquisición no estén doblemente expuestas con el haz. Haga clic en Agregar área de enfoque automático y haga clic en cualquier lugar de la imagen.
Mueva el área de enfoque automático al carbono que rodea un agujero. La práctica estándar es enfocar automáticamente después del centrado cuando se usa AFIS o cada cinco a 15 micrómetros, dependiendo de la variación de altura Z en todo el cuadrado. Haga clic en Agregar área de medición de deriva.
La medición de deriva se realiza una vez por cuadrado de cuadrícula con un umbral establecido de 0,05 nanómetros por segundo como ajuste estándar. El área de medición de deriva puede superponerse directamente con el área de enfoque automático. Asegúrese de que ni la deriva ni el área de enfoque automático se superpongan con un área de adquisición.
Vuelva a la selección de cuadrados y seleccione los cuadrados para su adquisición en la cuadrícula. Utilice el número de áreas de adquisición y la tasa de adquisición de datos esperada para predecir cuántas áreas de adquisición se requieren. Cuando se seleccionen todos los cuadrados deseados, presione preparar todos los cuadrados.
Una vez que se haya recogido cada cuadrado, navegue entre los cuadrados de la cuadrícula y ajuste los taladros con el pincel de selección. Desplácese a una ubicación de escenario sobre la muestra y use funciones automáticas para establecer la altura eucéntrica. Realice alineaciones de microscopio utilizando el software de microscopio como se describió anteriormente y en el texto.
Realice la alineación libre de coma dentro de las funciones automáticas antes de reinsertar y centrar la apertura del objetivo y corregir el astigmatismo de la lente del objetivo con EPU. Asegúrese de que ambas alineaciones convergen en valores adecuados. Antes de iniciar la ejecución de adquisición automatizada, asegúrese de que la turbobomba cargadora automática esté apagada y que se inserte la apertura del objetivo si es necesario.
En la adquisición automatizada, presione iniciar ejecución para comenzar la adquisición automatizada de datos. Usando este protocolo, las rejillas rotas o secas se pueden examinar y descartar en la etapa del atlas. Se observa un gradiente de hielo en la mayoría de las rejillas.
Durante el cribado, una distribución de partículas ideal se monodispersa con un rango de orientaciones de partículas visibles. Si el hielo es demasiado delgado, puede derretirse cuando se ilumina con el haz de electrones, causando un movimiento excesivo en la micrografía. Esto se observa más comúnmente cuando hay detergente en el tampón.
El hielo debe ser vítreo, por lo que se excluyeron las áreas de la cuadrícula donde la mayoría de las imágenes muestran hielo cristalino. Se incluyó un resumen gráfico de los datos para evaluar la calidad de la micrografía y decidir si se requieren modificaciones en la recopilación de datos. Los recolectores de partículas como crYOLO funcionan lo suficientemente bien para una primera pasada de los datos, lo que permite la progresión a un promedio de clase 2D.
Las clases que muestran detalles de la estructura secundaria deben elegirse para el análisis 3D, mientras que las partículas basura deben descartarse. Se puede utilizar un subconjunto de partículas para generar un modelo inicial para la clasificación y el refinamiento en 3D. En el caso de RagAB, el conjunto de datos contenía tres conformadores distintos que se pueden separar durante la clasificación 3D.
Es importante recordar que el éxito en la adquisición de datos y los pasos posteriores de análisis de imágenes dependen de la obtención e identificación de cuadrículas bien optimizadas durante la etapa de detección. Una vez que se obtiene un mapa de densidad EM 3D, se puede interpretar aún más mediante el ajuste y refinamiento de un modelo de proteína o la construcción de un modelo atómico de novo. El análisis de una sola partícula crio-EM permite la determinación estructurada de muchos objetivos que antes no eran posibles.
En particular, estos flujos de trabajo se han utilizado recientemente para resolver estructuras de macromoléculas relacionadas con COVID-19.
