Este protocolo puede ayudar a los investigadores a separar fácilmente las retinas de los ratones y observar los cambios dinámicos en la vasculatura retiniana del modelo de ratón OIR. Las principales ventajas de este método son la preservación de la integridad de las retinas separadas y permitir que cada ratón sirva como su propio control, lo que hace que los resultados sean más comparables. Los investigadores que prueban este método por primera vez pueden tener dificultades al tomar las cinco imágenes de orientación porque es un poco difícil colocar a los cachorros en la posición correcta.
Para recolectar el tejido para el montaje completo de la retina, use tijeras curvas para desconectar los globos oculares del tejido orbital de un cachorro C57-Black / 6 sacrificado. Luego, inserte pinzas curvas en la parte posterior del globo ocular, sujetando el nervio óptico y levantando rápidamente el ojo de la órbita. Coloque los globos oculares en PBS preenfriado para eliminar el vello y la sangre de la superficie.
Cuando se hayan recogido todos los globos oculares, transfiera los globos oculares limpios a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga 4% de paraformaldehído e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente y de 12 a 15 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, agregue una gota de PBS al centro de una placa de cultivo bajo un microscopio de disección y coloque un globo ocular en la gota. Sosteniendo el globo ocular con un par de fórceps, use una aguja de jeringa de un mililitro para perforar cuidadosamente la córnea en el limbo corneal.
Inserte la punta de un par de tijeras en la punción y corte la córnea a lo largo del limbo corneal, teniendo cuidado de no cortar la retina. Use fórceps para extraer el iris y el cristalino, y coloque el ocular restante en paraformaldehído al 4% para una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente en el agitador. Al final de la incubación, coloque el ocular fijo en una gota fresca de PBS en el centro de un nuevo plato de cultivo.
Sosteniendo el ocular con un par de fórceps, use un segundo par de fórceps para separar suavemente las capas de retina y esclerótica. Coloque la punta de las tijeras entre las capas de retina y esclerótica, y corte la esclerótica hacia el nervio óptico. Despegue la esclerótica de la retina para obtener la copa retiniana.
Usando fórceps, libere la conexión entre los vasos hialoides radiales y la retina periférica. Use una pipeta de dos mililitros con la punta cortada para transferir la copa retiniana a un pocillo de una placa de 48 pocillos durante tres lavados de cinco minutos en PBS a temperatura ambiente en el agitador. Después del último lavado, incube la taza en 1% Triton X-100 y 5% de suero de burro normal en PBS durante la noche a cuatro grados centígrados.
Para marcar la vasculatura retiniana con isolectina B4, incubar la retina en un pocillo de una placa de 48 pocillos en 400 microlitros 0,1% suero de burro normal suplementado con isolectina B4-594 durante la noche a 4 grados centígrados en una coctelera. Si es necesario, se puede agregar otro anticuerpo primario al mismo tiempo. Al día siguiente, lave la retina con tres lavados de 20 minutos en PBST al 0,1% en el agitador.
Después del último lavado, incubar la retina con un anticuerpo secundario apropiado de alta afinidad durante una hora a temperatura ambiente antes de etiquetar la muestra con DAPI durante 20 a 25 minutos. Al final de la incubación, lavar la retina con tres lavados de 30 minutos en PBST al 0,1% a temperatura ambiente con agitación. Después del último lavado, transfiera la copa retiniana a un portaobjetos limpio con la abertura hacia arriba, y use el microscopio para cortar la retina radialmente en las posiciones de las tres, seis, nueve y 12 en punto desde la periferia hacia el centro, hasta uno a 1,5 milímetros de la cabeza del nervio óptico.
Enjuague la retina tres veces con unas gotas de PBS por lavado antes de usar papel colocado al aire para secar y aplanar la retina. Agregue una gota de medio de montaje al centro del cubreobjetos hasta que el diámetro de la gota cubra la mitad del cubreobjetos. Luego, coloque rápidamente el cubreobjetos con el lado medio de montaje hacia abajo sobre la retina extendida.
Una vez que se han preparado todos los soportes planos de retina, las muestras se pueden obtener imágenes mediante microscopía de fluorescencia confocal. Para obtener imágenes in vivo, agregue 20 microlitros de gotas oftálmicas midriáticas para lograr una dilatación de la pupila duradera. Después de cinco minutos, coloque a los cachorros en una posición estable en una pequeña almohadilla térmica frente al dispositivo de imágenes.
Para mantener la humedad en las córneas, agregue regularmente lágrimas artificiales durante todo el procedimiento de imágenes. A continuación, haga clic en Imágenes de fondo de ojo infrarrojo en el dispositivo para ajustar la cabeza del nervio óptico al centro de la pantalla. Inyecte por vía intraperitoneal 150 microlitros de solución salina de sodio con fluoresceína al 0,5% e inmediatamente haga clic en los botones FA e Inyección en el panel táctil del dispositivo de imágenes para iniciar el temporizador.
Después de tres minutos, cuando la circulación sanguínea de la retina haya entrado en la fase venosa, adquiera la primera imagen de la retina central. Mueva la lente del dispositivo de diagnóstico por imágenes horizontalmente hacia el lado nasal del ojo hasta que la cabeza del nervio óptico esté ubicada en el punto medio de un lado del área de adquisición de imágenes y tome la segunda imagen. Continúe moviendo el cristalino y adquiera imágenes de la retina temporal, superior e inferior de la misma manera.
Para procesar las imágenes de la retina en un programa de procesamiento de imágenes adecuado, abra el menú Archivo y haga clic en Nuevo para crear un nuevo lienzo con un fondo negro. Abra la imagen de la retina central. A continuación, haga clic en Archivo para agregar una segunda imagen.
Ajuste la opacidad de la segunda imagen al 60% y mueva y cambie el tamaño de la imagen hasta que las dos imágenes se superpongan. Haga clic en Cambiar entre los modos de transformación libre y deformación, y realice ajustes sutiles en los recipientes si es necesario. A continuación, vuelva a establecer la opacidad de la segunda imagen en 100%Seleccione ambas imágenes y haga clic en Capas de fusión automática.
Marque Panorama como método de fusión y también marque las casillas Tonos y colores sin fisuras y Áreas transparentes de relleno conscientes del contenido. Haga clic en Aceptar para completar la unión de las dos primeras imágenes. A continuación, agregue la tercera imagen y cose esta imagen a las dos primeras imágenes como se demostró hasta que se hayan cosido las cinco imágenes de una sola retina.
Cuando se hayan procesado todas las imágenes del análisis, utilice la herramienta Recortar para recortar las imágenes FFA a un tamaño uniforme para facilitar la observación de los cambios en la dinámica de la vasculatura retiniana en diferentes puntos de tiempo de desarrollo. Después de cinco días de exposición a la hiperoxia, las retinas centrales de las crías postnatales del día 12 demuestran una gran área de no perfusión. Tras la transferencia a cinco días de condiciones hipóxicas, las retinas se neovascularizan gradualmente, exhibiendo un aumento en la señal de fluorescencia más fuerte que la observada en los vasos normales circundantes.
Después del día postnatal 17, la neovascularización patológica retrocede rápidamente y la retina muestra una apariencia completamente normal para el día postnatal 25. Se puede lograr una buena repetibilidad y estabilidad del modelo de retinopatía inducida por oxígeno controlando el tamaño de la camada y el aumento de peso postnatal de los cachorros. Como se observa, la vaso-obliteración típicamente alcanza su punto máximo en el día postnatal 12 y desaparece en el día postnatal 25, mientras que la neovascularización alcanza su punto máximo en el día postnatal 17 y retrocede en el día postnatal 25.
En el día postnatal 15 a 25 ratones con retinopatía inducida por oxígeno, el diámetro de los vasos sanguíneos retinianos aumenta y se vuelve altamente tortuoso en comparación con el observado para las retinas de ratones normales. Los fórceps en la mano izquierda juegan principalmente un papel de apoyo. Tenga cuidado de no apretar el globo ocular, que puede deformarlo o romperlo.
