Este protocolo ofrece un método para mapear las fuerzas moleculares generadas por las células y particularmente las células inmunes. El protocolo es crítico para los laboratorios interesados en estudiar la mecanotransducción en mecanobiología. La principal ventaja de esta técnica es que es súper fácil y permite utilizar la microscopía de fluorescencia convencional para cuantificar la transmisión de fuerza en células inmortalizadas y primarias.
Para comenzar, coloque cubreobjetos de 25 milímetros en una rejilla de politetrafluoroetileno en un vaso de precipitados de 50 mililitros y enjuague los cubreobjetos tres veces sumergiéndolos en agua. Mezcle volúmenes iguales de etanol y agua y agregue 40 mililitros de esta solución al vaso de precipitados que contiene la rejilla y los cubreobjetos. Luego, selle el vaso de precipitados con cinta de parafilm.
Limpie los cubreobjetos sonicando el vaso de precipitados durante 15 minutos en un limpiador ultrasónico y deseche el líquido después de la sonicación. Luego, enjuague el vaso de precipitados que contiene la rejilla y los cubreobjetos con agua al menos seis veces para eliminar cualquier solvente orgánico restante. Para preparar una solución fresca de piraña, agregue 30 mililitros de ácido sulfúrico a un vaso de precipitados de 50 mililitros y agregue lentamente 10 mililitros de peróxido de hidrógeno.
Mezclar suavemente la solución de piraña con el extremo de una pipeta de vidrio. Para iniciar el grabado, transfiera la rejilla que sujeta los cubreobjetos al vaso de precipitados que contiene la solución de piraña e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para limpiar e hidroxilar los cubreobjetos. Luego, transfiera la rejilla con pinzas de acero o politetrafluoroetileno a un vaso de precipitados limpio de 50 mililitros y enjuague con agua seis veces.
Para eliminar el agua por completo, sumerja la rejilla que sostiene los cubreobjetos en un vaso de precipitados de 50 mililitros con 40 mililitros de etanol. Luego, deseche el etanol. A continuación, sumerja la rejilla en 40 mililitros de etanol que contenga 3% de aminopropiltrietoxisilano durante una hora a temperatura ambiente para iniciar la reacción con el grupo hidroxilo en los cubreobjetos.
Enjuague la superficie de los cubreobjetos seis veces sumergiéndolos en 40 mililitros de etanol y séquelos en un horno a 80 grados centígrados durante 20 minutos. Cubra el fondo interno de la placa de Petri con una cinta de parafilm para evitar que los cubreobjetos se deslicen dentro de la placa de Petri. Luego coloque los cubreobjetos cubiertos de amina con el lado a funcionalizar con sondas de tensión de ADN hacia arriba.
Cubra los cubreobjetos a 20 grados centígrados para su uso futuro. Para modificar los grupos amina en los cubreobjetos, agregue ácido lipoico PEG NHS y mPEG NHS e incube la placa de Petri a temperatura ambiente durante una hora. Al final de la incubación, enjuague la superficie tres veces con agua.
Después de eso, agregue 100 microlitros de bicarbonato de sodio molar 0.1 que contenga un miligramo por mililitro de acetato de sulfo-NHS a un conjunto de cubreobjetos de sándwich e incube durante 30 minutos para que ocurra la pasivación. Agregue 0,5 mililitros de nanopartículas de oro a cada cubreobjetos e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, enjuague los cubreobjetos con agua tres veces.
Después de agregar la hebra Black Hole Quencher 2 a la sonda de tensión de ADN recocido en una proporción de diez a uno, agregue 100 microlitros de la mezcla por dos cubreobjetos para hacer el sándwich. Coloque cuidadosamente una bola de tejido de laboratorio húmeda en la placa de Petri, lejos de los cubreobjetos, y selle el plato con cinta de parafilm para evitar que la solución se seque. Después de eso, cubra el plato con un papel de aluminio e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, ensamble la cámara de imágenes, teniendo cuidado de evitar el agrietamiento de la superficie mientras aprieta la cámara. Luego, agregue de 0.5 a un mililitro de la solución salina equilibrada de Hank a la cámara de imágenes. Utilice el canal Cy3B con un objetivo 100X para capturar señales fluorescentes de células chapadas en las sondas de tensión de horquilla de ADN cuando comienzan a propagarse.
Después de preparar 100 cepas de bloqueo no fluorescentes micromolares, en el momento deseado, agréguelas a las células a una concentración final de un micromolar en la cámara de imágenes para almacenar la señal de tensión y mézclela con las células mediante pipeteo. Después de unos 10 minutos de bloqueo, adquiera películas de lapso de tiempo o imágenes de punto final en epifluorescencia tanto para el mapeo de tensión cualitativo como para el análisis cuantitativo. Una superficie exitosa tenía un color rosa pálido.
La alta calidad de la superficie se demostró con un fondo limpio y la microscopía de contraste de interferencia de reflexión o canal RICM y la intensidad de fluorescencia uniforme en el canal Cy3B. Las imágenes de lapso de tiempo de bloqueo de tensión indicaron que tanto las señales de tensión TCR anti-CD3 épsilon como TCR-péptido-MHC se amplificaron debido al bloqueo de horquilla y la acumulación de señal. La hebra de bloqueo registró eventos de tracción mecánica de corta duración del péptido TCR MHCN4 a partir de cero minutos, lo que facilitó el análisis cuantitativo y reveló el patrón distintivo de la fuerza MHC del péptido TCR que se asemejaba al patrón de diana de las sinapsis inmunes.
En cada paso, la preparación del sustrato de la sonda de intención necesita atención al detalle y un manejo cuidadoso de los materiales. Esta tecnología permite la visualización de las fuerzas moleculares transitorias que ocurren en la superficie celular cuando interactúa con el medio ambiente, especialmente en las células inmunes en busca de antígenos.
