Para la electroantenografía, el uso de mosquitos en un estado fisiológico específico y consistente es fundamental para obtener resultados confiables. El protocolo paso a paso permite registros electroantennográficos duraderos en mosquitos. El método se puede utilizar en varias especies de mosquitos, y tanto en machos como en hembras.
La técnica electroantennográfica también se puede trasladar a otros modelos de insectos, incluidos escarabajos, moscas, vinchucas y hormigas. Para comenzar, retire los viales de ámbar de 1,5 mililitros que contienen las mezclas odorantes y un control de solvente del congelador de 20 grados centígrados en el que se almacenan para evitar la degradación. A continuación, pipetear 10 microlitros de la solución odorante en un trozo de papel de filtro cargado dentro de una jeringa de vidrio etiquetada.
Aísle los mosquitos el día del experimento. Trabajando bajo el microscopio, rompa suavemente la punta de dos capilares de borosilicato con filamentos usando un par de pinzas. Antes de ejecutar la electroantenografía, o experimento EAG, asegúrese de que los soportes de electrodos estén limpios en el interior, sin restos de borosilicato.
Luego realice la cloridización empapando los cables plateados de los soportes de electrodos en lejía pura durante cinco minutos, hasta que los cables se vuelvan oscuros, gris mate. Luego enjuague los cables. Afloje el tapón de goma y use una aguja de calibre 20 para llenar el interior del capilar con solución salina.
Enjuague los capilares e inserte los cables en los dos capilares. Mantenga la punta del cable a menos de un milímetro de la punta del capilar. Pase el capilar a través del anillo de goma dentro del soporte del electrodo sin romperlo y apriete suavemente el tapón de goma, después de verificar que no haya burbujas de aire.
Utilice el capilar con la abertura más ancha en el soporte del electrodo de referencia y la abertura más pequeña en el soporte del electrodo de grabación. Deje los dos portaelectrodos montados en una toallita de limpieza húmeda para evitar que la punta se seque hasta que esté lista para montar el cabezal. Asegúrese de que la mesa de aire esté levantada.
No hay bloqueo en la aerolínea y el aire está encendido. Verifique que el tanque de aire medicinal esté lleno para evitar cambiarlo en medio del experimento y confirme las burbujas en el humidificador. Encienda las computadoras, las aplicaciones de software y la fuente de alimentación de la válvula.
Después de verificar la conexión a Internet, entregue un pulso de control para verificar que la válvula que entrega los pulsos sea funcional. Coloque una placa de aluminio sobre hielo con un trozo de limpieza húmeda sobre ella y coloque una pequeña cucharada de gel de electrodo en una esquina. Coloque una taza para mosquitos en hielo para dejar que el mosquito se enfríe.
Recorte la punta de cada antena del mosquito con micro tijeras. Use pinzas para arrastrar el mosquito junto a la cucharada de gel del electrodo y sumerja suavemente la punta de cada antena en el gel. Usando fórceps, saque las antenas de mosquitos, mientras las mantiene una al lado de la otra.
Picar la cabeza del mosquito con micro tijeras. Sumerja suavemente la punta del electrodo de referencia en el gel y colóquelo en contacto con el cuello, dejando que la cabeza se pegue a él. Coloque el electrodo de cabeza de referencia en un micromanipulador.
Conecte ambos portaelectrodos al amplificador. Utilice el micromanipulador para colocar el electrodo de grabación lo más cerca posible de las puntas de la antena. Luego inserte las puntas de la antena en el electrodo de grabación.
Coloque el tubo de la aerolínea cerca de la preparación de la cabeza del mosquito, a un centímetro. Encienda el amplificador y el reductor de ruido y asegúrese de que la señal de línea de base no sea ruidosa. Una vez que el nivel de ruido sea satisfactorio, inserte la primera jeringa de olor en el orificio de la aerolínea para realizar la prueba y cierre la jaula de Faraday.
Luego haga clic en grabar en el software EAG para entregar el pulso. Mida las respuestas EAG como amplitud en milivoltios y luego proceda con el siguiente olor o concentración. El experimento demuestra con éxito que las especies de mosquitos pueden exhibir respuestas olfativas variables a diferentes productos químicos.
Hubo una ausencia de respuesta al aceite mineral, que se utilizó como control negativo. El error en los resultados debido al ruido eléctrico se puede reducir conectando a tierra los elementos a la jaula de Faraday, utilizando pinzas de cocodrilo. El umbral de respuesta al mismo olor puede variar en magnitud para diferentes especies de mosquitos.
Por ejemplo, los mosquitos Toxorhynchites rutilus septentrionalis producen EAG muy grandes, en comparación con Aedes aegypti, Anopheles stephensi y Culex quinquefasciatus. Se observó una gran desviación en respuesta al control positivo, benzaldehído. Si bien hubo una falta de respuesta al control negativo, el aceite mineral.
Estas respuestas antenales promedio se muestran en un diagrama de barras. Además, el umbral de detección de una sustancia química específica para cada especie de mosquito se determinó presentando la antena, las concentraciones crecientes de la sustancia química y trazando una curva de dosis-respuesta. Es importante comenzar la grabación tan pronto como sea posible después de que la cabeza haya sido cortada y montada, para garantizar una gran capacidad de respuesta de la preparación.
EAG permite determinar si las antenas del mosquito responden a una sustancia química dada a una concentración dada. Sin embargo, no permite determinar el equilibrio de este producto químico. Por ejemplo, si es un atrayente o un arrepentimiento.
