En esta partícula, introducimos una plataforma de reconstitución in vitro que imita el entorno lipídico de la membrana interna de las mitocondrias. Esta plataforma se puede utilizar para investigar los mecanismos moleculares de la fusión de la membrana interna de las mitocondrias. La principal ventaja de esta técnica es que permite la investigación cuantitativa de proteínas de membrana integral y proteínas asociadas a la membrana en un entorno casi nativo.
Para comenzar, mezcle las soluciones A y B de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, luego genere la mezcla de lípidos añadiendo el volumen calculado de solución de almacenamiento en viales de ámbar con una jeringa de vidrio. Haga coincidir el volumen final añadiendo cloroformo adicional a los viales. Hornear microscopio cubiertael vidrio se desliza a 520 grados Celsius durante 30 minutos.
Después de hornear, enfríelos a temperatura ambiente. Añadir aproximadamente 10 gramos de hidróxido de sodio a 500 mililitros de metanol durante la agitación. Revuelva durante dos horas, continuando añadiendo hidróxido de sodio a la solución hasta que el precipitado comience a mostrarse.
Limpie los portaobjetos de vidrio en una solución de dodecil sulfato de sodio al 10%, metanol saturado con hidróxido de sodio y ácido clorhídrico de 50 mililitros, bañando secuencialmente los portaobjetos bajo cada condición durante 30 minutos. Limpie los toboganes de vidrio en agua ultrapura durante 10 minutos entre cada condición. Almacene la cubierta limpia sellada en solución de ácido clorhídrico durante un máximo de dos semanas para garantizar una buena calidad de dos capas.
Limpie el canal de politetrafluoroetileno del sistema de inmersión Langmuir-Blodgett utilizando cloroformo y agua ultrapura hasta que no se observe humectación. Rocíe el cloroformo en la superficie de la vaguada y límpielo bien tres veces con toallitas de celulosa, luego enjuáguelo tres veces con agua ultrapura y retire el agua a través de la succión. Cuando haya terminado, cubra la superficie de la vaguada con agua ultrapura limpia.
Tome dos piezas de vidrio de cubierta tratada en superficie de la solución de limpieza y enjuáguelas con agua ultrapura durante aproximadamente 30 segundos. Coloque el tapón de forma consecutiva utilizando la abrazadera de sustrato para sujetar los portaobjetos de vidrio. Sumerja el tobogán de vidrio debajo de la superficie del agua haciendo clic manualmente en el sistema de control Langmuir.
Cero el balance de la película y extender cuidadosamente la solución B gota a gota en la interfaz de agua de aire. Asegúrese de que los lípidos sólo se están extendiendo en la interfaz de agua de aire sin tejas de cloroformo y lípidos que se hunden en la parte inferior de la superficie de politetrafluoroetileno, lo que creará un canal lipídico y evitará la formación de monocapas. Deje de agregar lípidos cuando la lectura del balance de la película sea de alrededor de 15 a 20 milanutón por metro.
Espere de 10 a 15 minutos y, a continuación, inicie el controlador de barrera para modificar el área de superficie haciendo clic en Iniciar experimento. Espere hasta que la lectura del balance de la película aumente a 37 milanculonidad por metro y mantenga la presión durante aproximadamente 20 a 30 minutos. Levante la cubierta a una velocidad de 22 milímetros por minuto mientras mantiene la tensión superficial a 37 milímetros por metro.
Una monocapa lipídica con anclaje de polímero se transferirá de la interfaz de agua de aire a la superficie del vidrio a través del proceso de inmersión de Blodgett, formando el foliolo inferior de la capa bicapa lipídica. Limpie la interfaz de agua de aire por succión y enjuague la vaguada con agua ultrapura. Después de limpiar un portaobjetos de vidrio de un pozo con cloroformo, etanol y agua ultrapura, establézcalo en la vaguada debajo de la capa de agua.
Asegúrese de que el pozo está mirando hacia arriba hacia la interfaz de agua de aire y vierta agua ultrapura fresca hasta que el portaobjetos de vidrio esté completamente cubierto, luego sumerja el portaobjetos de vidrio debajo de la superficie del agua como se describió anteriormente. Sujete la cubierta con la monocapa lipídica usando una ventosa de silicio y empuje suavemente la monocapa lipídica a la interfaz de agua de aire. Sujete el cristal de la cubierta durante dos o tres segundos en la interfaz y, a continuación, empújelo contra la corredera.
Saca la corredera con el vaso. Lleve la cubierta y la bicapa a un microscopio de epifluorescencia e imagine la bicapa lipídica de acuerdo con las instrucciones del manuscrito del texto. Prepare un plato de cristalización que contenga agua ultrapura y coloque un anillo de imagen de microscopio limpio debajo del plato.
Sumerja esta diapositiva y el vidrio de la cubierta que contiene la bicapa lipídica debajo del agua. Separe suavemente la corredera y el cristal de la cubierta, sosteniendo la corredera de la cubierta de la parte inferior y transfiera el vaso de la cubierta al anillo de la imagen. Sustituya el agua ultrapura del anillo de imagen por un tampón de cloruro sódico bis-tris, asegurándose de que la capa bicapal lipídica no esté expuesta a ninguna burbuja de aire.
Añadir 1,1 nanomolar n-octyl-beta-glucopyranoside al bicapa lipídica, luego añadir inmediatamente la mezcla de 1,2 DDM nanomolares y 1,3 picomoles de L-OPA1 purificado en el anillo de imagen. Incubar la muestra en una coctelera de sobremesa a baja velocidad durante dos horas. Distribuya 30 miligramos de perlas de resina SM-2 en tres mililitros de tampón bis-tris y agite.
Utilice una pipeta de plástico para añadir de 5 a 10 microlitros de las perlas de resina SM-2 al anillo de imagen e incubarlo durante 10 minutos, luego enjuague las perlas de resina. El volumen final del búfer en el anillo de imagen debe ser de 1,5 mililitros. Preparar un miligramo de mezcla de lípidos A en solución de cloroformo, luego evaporar cloroformo bajo flujo de nitrógeno durante 20 minutos.
Mantenga la mezcla al vacío durante la noche para formar una película de lípidos. Preparar 50 tampón que contenga calcio mili evolucionado disuelto disolviendo 15,56 gramos de calceina en 50 mililitros de solución de hidróxido de sodio molar 1,5 molar. Revuelva la mezcla a temperatura ambiente hasta que la calceína se disuelva por completo.
Añadir 12,5 bis-tris milimétricos y agua ultrapura para un volumen final de 500 mililitros y ajustar el pH a 7.5. Dispensar película de lípidos en el tampón que contiene calceína, luego hidratar completamente el lípido calentando la suspensión a 65 grados Celsius durante 20 minutos. Formar liposomas de 200 nanómetros a través de la extrusión con una membrana de policarbonato.
Añadir dos microgramos de L-OPA1 en 0,5 DDM micromolar, 2,2 miligramos de liposoma e incubar la solución a cuatro grados centígrados durante 1,5 horas. Retire el tensioactivo mediante diálisis con un casete de diálisis de 3,5 kilodalton contra 250 mililitros de 25 bis-tris mililitros, 150 cloruro de sodio mililolar y 50 tampón de calcio militrolar a cuatro grados centígrados durante la noche, cambiando el tampón dos veces. Elimine la calceína adicional utilizando una columna de desalado PD10 y, a continuación, continúe con el análisis de imágenes y datos como se describe en el manuscrito de texto.
Aquí se muestran imágenes de microscopía de epifluorescencia de una capa bicapa lipídica y su fluidez lipídica. La distribución de lípidos se muestra antes y después del blanqueo fotográfico y la homogeneidad se muestra antes y después de la reconstitución. L-OPA1 reconstituido y lípido bicapa fue validado por espectroscopia de correlación de fluorescencia o FCS.
Las curvas FCS indicaron que el 75% de L-OPA1 se reconstituyó en la bicapa lipídica, lo que sugiere que L-OPA1 se difunde libremente en la bicapa de lípidos atados con el potencial de autoensamblarse en complejos funcionales. El blanqueo por pasos de fluorescencia indicó que se reconstituyeron un promedio de dos a tres copias de L-OPA1 en un liposoma determinado. La distribución del tamaño de los proteoliposomas reconstituidos L-OPA1 se probó después de la reconstitución utilizando DLS y se verificó con FCS.
El anclaje de membranas fue monitoreado observando la señal de Texas Red en la superficie de la bicapa lipídica usando microscopía TIRF. La desmezcla o hemicusión de lípidos de membrana fue monitoreada a través de Texas Red a medida que el marcador liposoma se difundía en la capa bicapal de lípidos. El desenganchamiento de calceína ayudó a distinguir la formación completa de poros de fusión de sólo la desmezcla de lípidos, lo que permite la comparación entre las condiciones en las que las partículas se estancan en la hemumisión y las partículas que proceden a la fusión completa.
El anclaje de membranas fue indicado por una señal lipídica estable de liposomas y la señal de derrame no presentaba desencandalicemiento en la señal de calceína, pero una rápida descomposición de la señal roja de Texas indicaba la difusión del tinte en la capa bicapa lipídica. La fusión completa contó con la descomposición de lípidos y la liberación de contenido. Al intentar esta partícula, recuerde limpiar a fondo tanto el cubrecubos como la vaguada de Langmuir para asegurarse de que se fabrican las dos capas de alta calidad.
Una buena calidad del aire también es fundamental para evitar defectos en la capa bicapa. Esta técnica allana el camino para explorar nuevas preguntas en la dinámica y organización de la membrana de las mitocondrias. El emocionante experimento futuro incluye la exploración de la influencia de la asimetría de dos capas, el potencial de membrana y los mutantes relacionados con la enfermedad en la dinámica de la membrana interna de las mitocondrias.
