Este protocolo puede evaluar cómo la administración de genes dirigidos afecta la localización y la función de las células B-1a y puede ser una prueba útil del enfoque conceptual para examinar los potenciales terapéuticos genéticos in vivo. Este método proporciona una administración de genes estable y relativamente eficiente a las células primarias B-1a y permite la identificación del fenotipo celular del donante y la transferencia post-adoptiva de la función. Este método se puede utilizar para examinar diversos procesos de células donantes y huésped in vivo, incluyendo la supervivencia celular, la proliferación y la función, y se puede aplicar a otros sistemas de transferencia adoptiva.
La recolección de líquido peritoneal puede ser complicada. Asegúrese de desengallar completamente las células para maximizar la recuperación y evitar perforar los intestinos que pueden contaminar su población de células peritoneales. Para la recolección de células peritoneales B-1, utilice tijeras quirúrgicas rectas para hacer un corte superficial en el abdomen de un ratón de 12 a 14 semanas de edad, macho, CD45.1 + apolipoproteína E knockout, y utilice tijeras curvas para pelar la piel para exponer la pared peritoneal.
Con una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 25, enjuague la cavidad peritoneal con 10 mililitros de 37 grados Celsius RPMI-1640 medio. Y agarre la base de la cola para permitir que el ratón se sacuda completamente de lado a lado durante 15 a 20 segundos. Después de agitar, utilice la jeringa para aspirar el líquido desde la parte inferior derecha del peritoneo justo por encima del nivel de la cadera, cerca de los intestinos, teniendo cuidado de evitar interrumpir los depósitos epidimales de grasa y los órganos subyacentes.
Después de recoger de seis a siete mililitros de lavado, dispensar el líquido en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Utilice fórceps para agarrar la pared peritoneal por encima del diafragma para permitir la elevación vertical del animal de modo que cualquier líquido restante permanezca en la parte inferior de la cavidad peritoneal. Utilice tijeras quirúrgicas para hacer un pequeño corte en la pared peritoneal por encima del hígado sin cortar el hígado en sí.
Y use una tubería de vidrio y una bombilla para recoger cualquier líquido peritoneal restante. Cuando se haya recogido todo el líquido, aliquot las células de lavado peritoneal de todos los ratones y sumar hasta una por 10 a las octavas células por concentración de tubo en tubos de 50 mililitros en hielo. Y sedimentar las células por centrifugación.
Resuspender cada pellet en un mililitro de anticuerpo anti-CD16/CD32 diluido en una proporción de uno a 50 en el tampón del ensayo para una incubación de 10 minutos a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, agregue un volumen igual de mezcla maestra de anticuerpos biotinilados a cada tubo para una incubación de 20 minutos a cuatro grados Centígrados seguido de un lavado en cinco mililitros de tampón de ensayo por tubo. Resuspender los pellets con el volumen adecuado de micropergancias anti-biotina y la duración de incubación adecuada según la concentración celular y la recomendación del fabricante seguido de un lavado tampón de ensayo de cinco mililitros por tubo.
Resuspender cada pellet en 500 microlitros de tampón de ensayo y preparar el número adecuado de columnas de selección magnética con tres mililitros de búfer de ensayo por columna. Transfiera las células a columnas cebadas que recojan las células B-1 enriquecidas que contienen en un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo. A continuación, lave cada columna de selección magnética con búfer de ensayo adicional hasta que el volumen total recogido sea de 10 mililitros y resuspendir la fracción de celda post-purificada en una vez 10 a la sexta célula por concentración de mililitro en el medio de cultivo celular B.
Para estimular las células peritoneales B-1 reservar al menos una vez 10 a las séptimas células para un control no transducido y dividir las células restantes en dos volúmenes iguales para la transducción. Diluir las células a 1,5 veces 10 a las quintas células por cada 150 microlitros de concentración media y añadir 150 microlitros de células a pozos de una placa de fondo redondo de 96 pozos para la condición de transducción. Luego agregue 100 nanomolares de agonista TLR9 a cada pozo y coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante 16 a 18 horas.
Para la transducción retroviral de las células B peritoneales descongelar las existencias de partículas retrovirales de fosfato cálcico sobre hielo y añadir inmediatamente al control y el receptor de quimiocina retroviral sobrenadantes a cada pocótano de la placa apropiada y multiplicidad de infección de 20 a uno en presencia de 8 microgramos por mililitro de polibreno y beta-mercaptoetanol fresco a 55 micromolares de concentración final. Cuando se hayan añadido todos los virus, espinofec las células por centrifugación y coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante tres horas. Al final de la incubación, cosecha las células para su replating en medio de células B frescas y una incubación durante la noche.
Después del agotamiento magnético de otros tipos de células peritoneales, las células individuales vivas en la fracción post-agotamiento tienen una mayor proporción de células CD19+B en comparación con F4/80+macrofagos, y una falta de células CD5hi CD19-T, y contienen una mayor frecuencia de células CD19+CD5 mediana b-1a en comparación con la fracción de pre-agotamiento. Y el aumento de la frecuencia de los subconjuntos de células GFP+B-2, B-1, B-1a y B-1b transducidos con éxito está directamente correlacionado con el aumento de la multiplicidad de virus de infección. Y la eficiencia de transducción se puede aumentar aún más usando 96 placas de fondo redondo de pozo en comparación con el uso de placas de 24 o 6 pozos.
La transducción de retrovirus CXCR4-GFP puede inducir una sobreexpresión exitosa de la célula B-1 CXCR4 y aumentar la migración in vitro hacia CXCL12 sin un impacto significativo en la viabilidad de las células B. Además, las células de donante CD45.1+ transferidas de forma adoptiva sostuvieron su sobreexpresión de CXCR4 después de su recuperación de la médula ósea y el bazo de ratones receptores de CD45.2 17 semanas después de la transferencia celular. Cabe destacar que se ha determinado una asociación positiva entre la expresión CXCR4 y la localización celular del donante a la médula ósea, pero no al bazo.
Con una asociación positiva observada entre los números de células del donante en la médula ósea y la cantidad plasmática de lipoproteína de baja densidad anti-MDA IgM. Se pueden utilizar muchas técnicas adicionales para responder preguntas tales como, ¿cuál es el impacto de la administración de genes dirigidos en el desarrollo de la enfermedad o qué donantes deriva factores secretos afectan la fisiología del huésped.
