Este protocolo tiene como objetivo imitar el entorno clínico de la enfermedad residual después de la cirugía de desbulado tumoral, y por lo tanto nos permite probar nuevas terapias oncológicas en el contexto de la cicatrización postoperatoria de heridas. La ventaja de esta técnica es que permite estandarizar la cantidad de herida infligida y la cantidad de tumor que queda. Esta técnica es particularmente importante para los estudios preclínicos en la identificación de nuevos tratamientos para el cáncer, que recidivte localmente un ejemplo de lo cual es el sarcoma de tejidos blandos.
Esta demostración visual es fundamental para demostrar la técnica de inversión, que nos permite exponer el tumor unido al lado de la piel. Comience este procedimiento con la inoculación subcutánea de células cancerosas preparadas en ratones, como se describe en el protocolo de texto. En el día 12, después de la inoculación, cuando los tumores han alcanzado un tamaño de aproximadamente 50 milímetros cuadrados, ratones con 100 microlitros de buprenorfina por vía subcutánea en el escrúpulo del cuello, 30 minutos antes de la cirugía.
Configure el área quirúrgica con la almohadilla de calor cubierta con una capa de banco y configure un cono nasal para la anestesia. Organice equipos quirúrgicos limpios para que estén al alcance de la mano, incluyendo clorhexadina, hisopo, gasa, gel para los ojos, dos fórceps curvos, tijeras, aplicador de clip, removedor de clip y recargas de clip. Caliente la cámara de calentamiento a 37 grados centígrados y configure otra almohadilla de calor para la recuperación.
Tenga en cuenta que este procedimiento requiere dos personas. Un asistente debe vigilar de cerca la respiración del ratón durante el procedimiento. Después de anestesiar el ratón como se describe en el protocolo de texto, realice una prueba de pellizcar y una prueba de reflejo corneal para asegurarse de que el ratón está completamente anestesiado antes de comenzar la cirugía.
Cubra los ojos del ratón con una pequeña cantidad de gel oftálmico para evitar la sequedad ocular. Comience esta cirugía frotando el área quirúrgica con clorhexadina. Usando fórceps y un par de tijeras hacen una incisión recta de un centímetro a lo largo del lado dorsal, a tres milímetros del tumor.
No corte la piel que cubre directamente el tumor, ya que no sanará bien. Evite usar un bisturí para cortar el tumor y use pinzas para recoger las piezas. Con pinzas, retira la fascia y el tejido graso subcutáneo entre el tumor y el peritoneo.
El tumor subcutáneo normalmente se une al lado de la piel. Abra la herida sosteniendo suavemente la piel en el lado del rodamiento del tumor usando pinzas e invierta el tumor para que sea visible en el exterior. Usando un par de tijeras, corta la cápsula tumoral de la mitad para extraerla, comenzando desde la base del tumor más cercana a la abertura.
Para la cirugía del 50%debulk, corte a través de la mitad del tumor. El uso de fórceps curvos recoge la sección del tumor que se va a extirpar. Recoja los restos del área de debulk.
Para el 75%debulk, comienza por realizar un 50% de debulk tumor y luego corta a la mitad el 50% restante del tumor. Recoge el 25% del tumor usando fórceps curvos. Para cerrar el sitio quirúrgico, coloque el tumor restante debajo de la piel y usando fórceps, tire de los colgajos de la piel y alinee la piel a lo largo de la herida.
Sujete la piel a cinco milímetros del borde de la herida y utilice clips quirúrgicos para cerrar la herida comenzando en el lado, más cerca de los fórceps. Aplique tantos clips como sea necesario para asegurarse de que no se exponga ningún tejido subyacente. Generalmente, se aplican de tres a cuatro clips con espacios de dos milímetros entre clips.
Permita que los ratones se recuperen poniéndolos en la cámara de calentamiento caliente. Coloque la jaula del ratón en la almohadilla de calor. Monitoree a los ratones en la cámara de calentamiento hasta que se hayan recuperado del anestésico.
Luego, vuelva a colocar los ratones en la jaula, deje la jaula en la almohadilla de calor durante otros 10 minutos hasta que los ratones se hayan vuelto más activos. Dale a los ratones alimentos húmedos y suaves. Monitoree a los ratones una hora después de la cirugía para la recuperación.
Supervise los ratones de nuevo al final del día y a la mañana siguiente y asegúrese de que los clips permanezcan en su lugar. Tratar los ratones perioperatorios con terapia de advenimiento o neoadyuvante en un momento dado, dependiendo del tratamiento de interés. Por ejemplo, tratar ratones con una dosis de 100 microgramos de anti-CTLA-4 intraperitonealmente el día 15 después de la inoculación.
Alternativamente, tratar a los ratones con tres dosis de 200 microgramos de anti-PD-1 intraperitonealmente en días, 15, 17 y 19 después de la inoculación. La resección quirúrgica incompleta de 50 tumores de milímetros cuadrados, indicada aquí por la línea punteada da como resultado un recrecimiento 100% reproducible de los tumores en ausencia de inmunoterapia adyuvante. Por lo tanto, el crecimiento del tumor a un tamaño de 50 milímetros cuadrados es un tamaño ideal para el debulk parcial.
El modelo se utilizó entonces para probar inmunoterapias adyuvante utilizando anticuerpos contra módulos de punto de control, proteína asociada al linfocitos T citotóxicos cuatro y receptor de muerte programado uno. El tratamiento de ratones con anti-CTLA-4, dio lugar a una tasa de curación del 80%Mientras que el tratamiento de ratones con anti-PD-1 dio lugar a una tasa de curación del 25%La respuesta con anti-PD-1 ofrece la oportunidad de probar nuevas combinaciones, para mejorar aún más la tasa de respuesta. Es importante que el tumor restante permanezca unido a la piel, de lo contrario se cortará el suministro de sangre y el tumor se convertirá en el necrótico.
Después de este procedimiento, los tumores pueden ser analizados por una variedad de métodos, como la citometría de flujo con el fin de evaluar cómo la cirugía afecta a las células infiltrantes tumorales. Este modelo de ratón nos ha permitido explorar cómo la cicatrización de heridas afecta a las inmunoterapias contra el cáncer.
