La interacción HBX-DDB1 es un paso crucial para promover la transcripción del VPH de cccDNA, por lo que este protocolo puede convertirse en un activo clave para descubrir nuevos agentes terapéuticos para la cura funcional del VPH. Nuestro procedimiento es simple y requiere sólo un corto tiempo para la pantalla. La interacción que mezclo se puede detectar en tiempo real sin necesidad delismos celulares.
Además, la calidad de cribado es satisfactoria con una puntuación alta de Z prime. La inhibición de la interacción HBX-DDB1 conduce a la restauración de Smc5/6, lo que resulta en la supresión de la transcripción del VPH, la expresión de proteínas y la producción de cccDNA. Este nuevo mecanismo de acción antiviral puede superar las insuficiencias de las terapias actuales contra el VPH.
Las interacciones proteína-proteína son una clase importante de dianas farmacológicas. El ácido a base de luciferasa dividida descrito aquí, que se dirige a las interacciones entre las proteínas virales y hasS, puede proporcionar una nueva estrategia para desarrollar curas para otras enfermedades infecciosas. Aunque nuestro protocolo es simple y fácil de entender, algunos pasos pueden ser difíciles de reproducir sin la demostración visual.
Por lo tanto, la demostración visual será de gran ayuda para entender nuestro protocolo. Comience por sembrar cinco veces 10 a la 5a células HEK293T en un plato de 100 milímetros con 10 mililitros de DMEM, e incubarlos durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, diluya un microgramo cada uno de HBx-LgBit y SmBit-DDB1 expresando plásmidos de ADN y tampón de condensación de ADN para un volumen total de 300 microlitros.
Añadir 16 microlitros de solución potenciadora, y mezclar los tubos por vórtice durante un segundo. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante tres minutos y luego añadir 60 microlitros de reactivo de transfección. Vórtice el tubo durante 10 segundos e incubar la muestra durante otros ocho minutos.
Mientras tanto, aspirar el medio del plato con las células y lavarlos con cinco mililitros de PVS. Aspirar el PVS y añadir siete mililitros de DMEM. Añadir tres mililitros de DMEM al tubo con los complejos de transfección, pipeta arriba y abajo para mezclar, y añadir la mezcla a las células.
Luego, incubar las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 10 horas. Después de la incubación, retire el medio de cultivo gastado y lave las células con cinco mililitros de PVS. Retire el PVS a un mililitro de 0.25%trypsin EDTA, e incubar las células a 37 grados centígrados para separarlas.
A continuación, agregue cuatro mililitros de DMEM, y disperse el medio pipetándolo sobre la superficie de la capa celular varias veces, y transfiera la suspensión a un tubo. Centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos, luego desechar el sobrenadante, y volver a suspender el pellet celular en un mililitro de PVS. Repita la cerifugación y deseche el sobrenadante.
Luego, vuelva a suspender el pellet celular con un medio de cultivo celular amortiguado complementado con 10%FBS a una densidad de siembra de un millón de células por mililitro. Pipetear 50 microlitros de la suspensión celular en cada pozo de una placa de 96 pozos, y devolver las células a la incubadora de 37 grados celsius durante 10 horas. Mientras las células están incubando, diluir los compuestos de cribado y el disolvente a 13,5 X concentración.
Añadir 12,5 microlitros de sustrato luminiscente a cada pozo, e incubar la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mida la luminiscencia basal con un luminómetro y añada cinco microlitros de los compuestos y DMSO controlado a cada pozo inmediatamente después. Mida la luminiscencia cada 30 minutos durante dos horas y, a continuación, calcule los efectos inhibitorios de los compuestos en comparación con el tratamiento con DMSO.
Se midieron las señales de luminiscencia basales y la relación señal-fondo se calculó para ser superior a 80. El primo Z era mayor que 0,5, lo que indica que este sistema de ensayo es aceptable para la detección de alto rendimiento. Al establecer el umbral en más de 40%inhibición en comparación con el control sólo DMSO, nitazoxanida se identificó como un medicamento candidato.
Anteriormente identificamos nitazoxanida como un inhibidor de la interacción HBX-DDB1 mediante el cribado de una biblioteca compuesta a pequeña escala de reactividad con este método. Usando nitazoxanida, confirmamos que la inhibición de la interacción HBX-DDB1, esa reducción de la transcripción viral, y los niveles posteriores de productos virales. La porción óptima de la luciferasa dividida fusionada con una proteína diana debe determinarse de antemano.
En este caso, HPX fusionado con Bit Grande en la terminal C de HPX y DDB1 fusionados a Bit Pequeño en la terminal final de DDB1 proporcionó los mejores resultados.
