El uso del protocolo como un efecto biofísico de diferentes actuadores optogenéticos en la actividad cardiomiocitos se puede probar para ayudar en el desarrollo de experimentos optogenéticos en el tejido cardíaco y corazones enteros. Mediante la combinación de la técnica de abrazadera de parche con el seguimiento de sarcomere y mediciones de fuerza asistida de fibra de carbono, podemos estudiar los efectos de la fotoactivación GtACR1 en la electricidad y la mecánica de los cardiomiocitos ventriculares. La inhibición optogenética se puede utilizar potencialmente para la desfibrilación óptica.
GtACR1 es una herramienta optogenética que permite silenciar la actividad cardiaca. Esta técnica es totalmente aplicable a otros campos de investigación como los estudios de células musculares lisas y unicelulares. Aunque este protocolo no se puede utilizar para el cribado de alto rendimiento, proporciona un medio para el análisis integral de la función eléctrica y mecánica de cardiomiocitos.
Así que como dice el dicho, una imagen dice más de mil palabras. ¿Cuánta información más podemos transmitir en vídeo? Algunas de nuestras herramientas y técnicas involucradas en el estiramiento de miocitos individuales y en la preparación de la sonda son altamente intrincadas y es mucho más fácil transmitirlas en un video en comparación con una descripción.
Después de que la sangre se haya lavado del corazón con perfuma salino de un conejo blanco neozelandés de nueve a 10 semanas de edad, cambie el perfundato a una solución baja en calcio y alto contenido de potasio y perfuma el corazón durante dos minutos más después de que el corazón deje de latir. Perfunda la solución enzimática, comienza a recircular la solución enzimática de nuevo en el depósito después de dos minutos de digestión, y disminuye la velocidad a 16 mililitros por minuto después de cinco minutos de digestión. Una vez que el tejido aparece suave después de 40-50 minutos de digestión, cortar el corazón de la cánula e inmediatamente colocar el corazón en solución de bloqueo.
Agregue la solución de bloqueo hasta que el tejido esté completamente cubierto. Corte el ventrículo derecho y el tabique y separe el ventrículo izquierdo. Retire los músculos papilares y use fórceps finos y una pipeta para separar suavemente el tejido para liberar las células por disociación mecánica.
Filtrar la suspensión celular a través de una malla con poros cuadrados de un milímetro y sedimentar las células por centrifugación. A continuación, resuspender el pellet de cardiomiocitos en solución de bloqueo fresco. Para un experimento de abrazadera de parche, cubra los cubreobjetos autoclaves en una placa de Petri con 100 microgramos por mililitro de laminina inmediatamente antes del cultivo celular.
Para el experimento de fibra de carbono, cubra los platos de Petri con 0,12 gramos por mililitro de Poly-HEMA en una solución de 95 a cinco de etanol a agua. De diez a 15 minutos después de resuspender los cardiomiocitos, quitar el sobrenadante y resuspender las células en el medio de cultivo. Después de contar, siembra las células en un cubreobjetos en un plato de Petri a una densidad objetivo de 1.75 veces 10 a las cuatro células por mililitro.
Incubar los cultivos durante tres a cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Al final de la incubación, sustituya el medio de los cultivos de cubreobjetos por un medio fresco que contenga adenovirus tipo cinco que codifica para GtACR1-eGFP a una multiplicidad de infección de 75. Devuelva los cultivos a la incubadora durante 48 horas.
Para realizar un experimento de abrazadera de parche, utilice un tirador de micropipetas para extraer pipetas de parche de 1,7 a 2,5 megamios de capilares de vidrio de cal sodada e inicialice el software de adquisición de datos. Coloque un cubreobjetos con células en la cámara de medición que contiene la solución externa y seleccione el cardiomiocitos en función de su fluorescencia eGFP. A continuación, llene una pipeta de parche con solución interna y conecte la pipeta al soporte de pipeta que inserta el cable de grabación de plata recubierto de cloruro de plata en la solución interna.
Establezca la prueba de membrana para aplicar 10 pulsos de milivoltios durante 15 milisegundos con una línea de base de cero milivoltios. Después de alcanzar la configuración conectada a la celda, cambie al modo de celda completa con un potencial de retención de menos 60 milivoltios en el software de adquisición de datos. A continuación, aplique suavemente la presión negativa para acceder a toda la configuración celular rompiendo la membrana.
Una ruptura exitosa será evidenciada por un aumento inmediato en la capacitancia medida. Registre protocolos de fotoactivación en modo de abrazadera de voltaje a menos 74 milivoltios con pulsos de luz de 300 milisegundos o potenciales de acción en modo de abrazadera actual a cero picoampere. Para producir las fibras de carbono, primero monte la pipeta en los soportes de pipeta del tirador.
Tire de los capilares de vidrio en dos pipetas con una longitud total cónica de aproximadamente 11 milímetros y un diámetro interior final de unos 30 micrómetros. A continuación, utilice un microscopio estéreo para alinear un capilar en el círculo de orientación y doblarlo hasta 45 grados empujando hacia abajo en la punta del capilar con un doblador. Caliente el filamento hasta que el capilar mantenga el ángulo de 45 grados incluso después de retirar el doblador.
Después de doblar el capilar, utilice fórceps finos equipados con tubos suaves para tomar una fibra de carbono del tubo y colocarla en la punta fina del capilar. Empuje la fibra en el capilar hasta la curva. Cortar las fibras de carbono para que proyecten dos mililitros desde la punta del capilar y utilicen pegamento de cianoacrilato para fijar las fibras a la sección frontal de cada capilar.
Para calibrar las fibras, conecte un capilar a un soporte controlado por un micromaniprógrafo y un motor piezoeléctrico. Mueva el capilar hacia el sensor y alinee con respecto al sensor. Coloque la punta de la fibra en contacto con el sensor de fuerza sin producir ninguna fuerza.
El movimiento total del motor piezoeléctrico es de 60 micrómetros. Mueva el motor piezoeléctrico en seis pasos de 10 micrómetros hacia el sensor de fuerza. El sensor tiene una sensibilidad de 0,05 milinewtons por voltio y un rango de fuerza de cero a 0,5 mililitros.
Lea el voltaje medido para cada paso y retire la fibra de carbono del sensor. Para registrar la fuerza de contraer cardiomiocitos, cubra la superficie de un cubrecubos con Poly-HEMA y colóquelo en la cámara de medición. Llene la cámara con solución de baño externa.
Fije ambos capilares cargados de fibra de carbono al micromanipulador de etapa y alinee en un ángulo para que las fibras de carbono estén cerca de horizontal a la superficie de la cámara de medición. Para comprobar si las fibras están correctamente alineadas, concéntrese en la superficie de la cámara de medición, baje la primera fibra y mueva la fibra horizontalmente. La punta de la fibra debe estar deslizándose sobre la superficie de la cámara de medición.
Siga el mismo procedimiento para la segunda fibra. Con las luces apagadas, agregue unas gotas de suspensión celular cultivada a la cámara y aplique pulsos cortos de luz verde para seleccionar las células que se contraen en respuesta a la estimulación de la luz verde. Para conectar la primera fibra, comprima suavemente la célula bajando la fibra y luego suelte la presión.
Fijar la segunda fibra paralela a la primera en el otro extremo del cardiomiocitos para tener un número máximo de sarcomeres entre las dos fibras. Después de conectar ambas fibras, levante las fibras para que la célula ya no esté en contacto con la superficie de la cámara. Ponga los sarcomeres en el foco, establezca la ventana de seguimiento de la longitud de los sarcomos entre las fibras y utilice el módulo de detección de bordes para rastrear la flexión de la fibra.
Establezca las áreas de detección con las ventanas rojas y verdes y defina un umbral en la primera derivada de la traza de intensidad de luz. El ritmo óptico de la célula mientras se rastrea la longitud de los sarcomos y la flexión de fibra. En este caso, caminamos a 0,25 hercios.
Después de registrar al menos 15 contracciones ópticamente provocadas, el campo estimula la célula eléctricamente. Encuentre el umbral para obtener las contracciones y aplique 1,5 veces el voltaje umbral para el ritmo eléctrico. Para un protocolo de inhibición, aplique estímulos eléctricos para provocar contracciones y luego exponga la célula a un pulso de luz sostenido a varias intensidades de luz.
Registre al menos 15 contracciones después de la inhibición inducida por la luz. GtACR1 se expresa en cardiomiocitos de conejo cultivados. La fotoactivación GtACR1 a una intensidad de luz de cuatro milivatios por milímetro cuadrado durante 300 milisegundos da como resultado grandes corrientes dirigidas hacia adentro a menos 74 milivoltios con una corriente pico medida de 245 picoampere.
En este experimento representativo, los potenciales de acción se activaron eléctricamente con inyecciones de corriente 1,5 veces el umbral o ópticamente con pulsos de luz de 10 milisegundos. Los cardiomiocitos de ritmo óptico demostraron un inicio potencial de acción más lento. Los potenciales de acción activados eléctricamente fueron inhibidos bajo luz sostenida.
Las inyecciones de corriente más altas y 1,5 veces el umbral durante la aplicación de luz sostenida tampoco provocan potenciales de acción. El cardiomiocitos generó una fuerza de contracción de 232 micronewtones por milímetro cuadrado sobre el ritmo eléctrico y 261 micronewtones por milímetro cuadrado después del ritmo óptico. Los pulsos prolongados de luz verde inhibió las contracciones con las contracciones posteriores a la inhibición que generan una menor fuerza contráctil en consonancia con la pérdida de calcio diastólica de los cardiomiocitos de conejo.
Recomendamos practicar las técnicas antes de realizar un experimento, particularmente porque posicionar las microbios en la oscuridad puede ser un desafío. es muy importante cuando se analiza la contractilidad de cardiomiocitos, ya que puede afectar la producción de fuerza y la relajación. También se pueden aplicar varias cargas posteriores para el análisis de contracción isotónico y auxotónico.
Estas técnicas permiten caracterizar los efectos biofísicos de la activación de actuadores optogenéticos recientemente desarrollados en cardiomiocitos, lo que es crucial para seleccionar la herramienta optogenética más adecuada para cada experimento. Tenga en cuenta que la transducción de adenovirus y todos los pasos siguientes a la transducción deben realizarse en condiciones de nivel II de bioseguridad.
