Aquí presentamos un protocolo robusto para la detección de bacterias dentro del tejido vesical biopsiado, que tiene amplias aplicaciones a muchos tipos de tejidos donde se sospecha que hay bacterias presentes. La principal ventaja de esta técnica es que es imparcial. Permite al investigador detectar bacterias dentro del tejido sin conocimiento a priori de qué especies bacterianas está presente.
Esta técnica puede ayudar a determinar si las bacterias han invadido las paredes de la vejiga de las mujeres con infección urinaria recurrente e informar opciones terapéuticas como la selección de antibióticos que penetran en los tejidos. Mientras que está diseñado para los tejidos de la vejiga, esta técnica se puede aplicar ampliamente a otros tejidos con poblaciones bacterianas residentes con una optimización mínima. Las personas que son nuevas en esta técnica pueden tener problemas con la colocación de cubreobjetos y la toma de imágenes.
Concéntrese en optimizar la colocación de los cubreobjetos para reducir las burbujas y practicar la toma de imágenes en muestras no preciosas. Ayudar a demostrar este procedimiento será Jashkaran Gadhvi, un estudiante graduado en mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, limpie una campana de humo vacía o un gabinete de bioseguridad adecuadamente instalado con 70% de etanol.
Prepare todos los búferes y reactivos necesarios como se describe en el protocolo de texto. A continuación, limpie cinco frascos de Coplin con 70% de etanol y deje que los frascos se sequen. Cuando los frascos estén secos, etiquételos como se muestra aquí y llénelos con 100 mililitros de la solución adecuada.
En la campana de humo, coloque dos diapositivas por biopsia en un portaobjetos vertical. Coloque el portaobjetos vertical en el tarro de Xylenes 1 Coplin durante 10 minutos. Después de esto, retire el portaobjetos del frasco y borre la parte inferior de una toalla de papel para eliminar el exceso de xilenes.
Coloque el bastidor en el frasco de Xylenes 2 durante 10 minutos. Y luego rehidrata las secciones de tejido desfilinizadas en lavados sucesivos de etanol durante 10 minutos cada una. Cuando los lavados estén completos, borre la parte inferior del portaobjetos en toallas de papel para eliminar el exceso de etanol y coloque el estante en el frasco de Coplin que contiene 100 mililitros de agua destilada doble esterilizada con filtro durante 10 minutos.
Durante este lavado, diluya las sondas a 10 nanomolares en el tampón de hibridación para crear la solución de tinción, asegurándose de preparar 150 microlitros de solución de tinción por diapositiva. Prepare una cámara humidificadora para cada sonda añadiendo una delicada toallita de tarea empapada y arrugada y agua estéril a un depósito de una caja de punta P1000. Coloque el cartucho del soporte de la punta en la parte superior, ya que aquí es donde se sentarán las diapositivas.
Una vez completado el lavado final, retire el portaobjetos del portaobjetos y colóquelos en una toalla de papel fresca, con el lado tisú hacia arriba. Utilice una delicada toallita de tarea para secar el tobogán, teniendo cuidado de sólo deslizarse suavemente cerca, pero no en la sección de la biopsia para eliminar el agua. Usando una pluma hidrófoba, dibuje un borde alrededor de la sección de la biopsia y coloque el lado del tejido deslizante hacia arriba en la cámara humidificadora.
A continuación, coloque la cámara humidificadora en una incubadora de 50 grados centígrados. Pipetear entre 50 y 150 microlitros de la solución de tinción directamente en la parte superior del tejido para que el rectángulo hecho por el borde hidrófobo alrededor del tejido se llene y cierre la caja suavemente. Incubar durante la noche a 50 grados centígrados en la oscuridad.
Si la incubadora tiene una ventana, cúbrala con papel de aluminio para crear un ambiente oscuro. A la mañana siguiente, retire los portaobjetos de las cámaras humidificadora y elimine rápidamente cualquier solución de hibridación restante con una delicada limpieza de tareas. A continuación, coloque los lados en un estante de tinción vertical.
Coloque el estante de tinción en un frasco de Coplin envuelto en papel de aluminio que contenga 100 mililitros del tampón de lavado precalentó durante 10 minutos. Repita este paso de lavado dos veces más con un tampón de lavado fresco en los frascos nuevos de Coplin. Durante estos pasos de lavado, prepare la contramancha diluyendo una solución de stock de Hoechst 33342 en tampón de lavado, en una proporción de uno a 1000.
En el mismo tubo, añada aglutinina de germen de trigo Alexa-555 a una concentración final de cinco microgramos por mililitro y 555 de faloide a una concentración final de 33 nanomolares. Almacenar en la oscuridad hasta que esté listo para usar. Una vez completado el lavado final, retire los portaobjetos del frasco de Coplin y elimine suavemente cualquier tampón de lavado sobrante con una delicada toallita de tarea.
Coloque los portaobjetos boca arriba sobre una toalla de papel y agregue entre 50 y 150 microlitros de contramancha directamente sobre el tejido para que el borde hidrófobo se llene, pero no se desborde. Cubre hasta cuatro toboganes con una nevera criobox y incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, vuelva a colocar los portaobjetos en el estante de tinción y lávelos dos veces más en frascos de Coplin que contengan tampón de lavado fresco, con cada lavado que dure 10 minutos.
A continuación, seque bien los portaobjetos y colóquelos del lado tisú hacia arriba en una toalla de papel debajo de una criobox-top. Apriete una gota de soporte de montaje directamente en la parte superior del tejido y coloque suavemente un cubreobjetos de tamaño adecuado en la parte superior. Presione suavemente cualquier burbuja y deje que los portaobjetos se curen durante la noche en la oscuridad.
Al día siguiente, sella los bordes de los cubreobjetos a la corredera con una capa ligera de esmalte de uñas transparente y deja secar en la oscuridad durante 10 minutos, antes de guardarlos en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Cuando esté listo para tomar imágenes de las biopsias manchadas, encienda el microscopio confocal y el software asociado con el microscopio. Comience con una diapositiva positiva FISH y cambie al modo de visualización del ordenador.
Seleccione los canales para 405, 488 y 555. Establezca el agujero usando el canal de longitud de onda más largo, que en este caso es 555. A continuación, busque el plano focal actual para la visualización de bacterias etiquetadas en el canal 488.
Sin cambiar el plano focal, establezca la ganancia, la potencia del láser y el desplazamiento para cada canal de modo que la señal no esté saturada y el fondo no se corrija en exceso. Adquiera la imagen en los tres canales. En este estudio, las bacterias asociadas al tejido se detectan en biopsias de vejiga humana por 16S rRNA FISH.
Este protocolo se ha optimizado para la detección imparcial de bacterias asociadas con la mucosa de la vejiga en secciones de biopsia de vejiga incrustadas en parafina. Aquí se muestran micrografías confocales representativas de un experimento que utiliza este protocolo sobre secciones de biopsias vesicales obtenidas de mujeres con infecciones urinarias recurrentes. Dos secciones seriales se hibridan con el rRNA universal 16S o las sondas de codificación.
Las imágenes tomadas de la misma región del tejido y las bacterias son limpiamente visibles en el tejido hibridada con las sondas rRNA 16S, pero no están con la sonda de lucha. También son posibles resultados falsos positivos. En este falso positivo representativo, se detecta una señal correspondiente al colágeno o elastina autofluorescente en los canales 405 y 488 en las secciones de biopsia hibridada de sonda 16S y de codificación, destacando la importancia de utilizar siempre un control de sonda revuelto.
Para prevenir el foto-blanqueo, minimice la exposición del tejido a la luz después de aplicar las sondas. Si bien esta técnica permite la detección imparcial de bacterias en los tejidos humanos, no proporciona información específica a las especies. Multiplex-FISH con sondas específicas de taxonomía podrían utilizarse para identificar el género o especie presente.
Antes de desarrollar esta técnica, no se había demostrado previamente que las bacterias pudieran invadir la pared de la vejiga de los pacientes con infección urinaria recurrente humana. Ahora estamos usando sondas específicas de géneros y especies para determinar qué especies bacterianas están presentes. Los xilenos deben utilizarse en una campana de humo debido a su toxicidad.
Se debe tener cuidado de no mirar directamente al láser durante la toma de imágenes. El láser debe apagarse mientras se coloca la diapositiva bajo el objetivo.
