Este protocolo es significativo porque permite la generación de organoides de testículos, que se pueden utilizar como plataforma para el estudio de la morfogénesis de los testículos y para los exámenes de alta toxicidad y fármaco tropo. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente reproducible, requiere un número relativamente bajo de células y se puede utilizar para generar un gran número de organoides testiculares con arquitectura específica de testículos. Este método se puede aplicar para estudiar otros sistemas, como células madre pluripotentes o células de islotes pancreáticos con las optimizaciones necesarias.
Demostrar el procedimiento de digestión enzimática del tejido testicular será Anna Voigt, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Recoger los testículos en un vaso de precipitados estéril y lavar con PBS que contiene 1%estreptomicina de penicilina. Después del lavado transfiera los testículos a un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros con PBS que contiene 1%estreptomicina de penicilina.
Usa tijeras y fórceps autoclavados para eliminar la túnica vaginal y el epidídimo. Transfiera los testículos aislados a un nuevo plato de 100 milímetros y lávese bien con PBS que contenga estreptomicina 1%penicilina. Corte los testículos a lo largo del eje longitudinal directamente debajo de la túnica.
Luego pela los testículos de la túnica usando dos fórceps y colólolo en un nuevo plato de 100 milímetros que contenga 1 mililitro de DMEM con estreptomicina 1%penicilina. Picar los testículos pelados con tijeras estériles en trozos de tejido de uno a dos milímetros. Después de cortar, utilice fórceps estériles para eliminar los fragmentos blancos del tejido conectivo.
Transfiera los trozos de tejido picado a la solución A en un tubo de 50 mililitros y recargo hasta 50 mililitros con DMEM para obtener una concentración de 0,4 miligramos por mililitro para colagenasa 4S y una concentración de 0,8 miligramos por mililitro para colagenasa 4W. Coloque el tubo que contiene los trozos de tejido en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 30 minutos. Invierta suavemente el tubo cada cinco minutos.
Después de 30 minutos, centrifugar el tubo a 90 veces G con roturas a 25 grados centígrados durante 1,5 minutos. Desechar el sobrenadante, ad 40 mililitros de solución B, y recargar hasta 50 mililitros con DMEM para obtener una concentración de 1,2 miligramos por mililitro de colagenasa 4W. Coloque el tubo en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 30 minutos e invierta suavemente el tubo cada cinco minutos.
Centrifugar el tubo a 90 veces G con roturas a 25 grados centígrados durante 1,5 minutos. Después de eso desechar el sobrenadante, y lavar una vez con PBS con 1%penicilina estreptomicina. Recoja cuidadosamente los túbulos de la parte superior y colóquelos en un nuevo tubo de 50 mililitros.
Renór la tapa del tubo con PBS hasta 50 mililitros. Centrifugar los túbulos a 90 veces G con roturas a 25 grados centígrados durante 1,5 minutos. Deseche el sobrenadante y agregue PBS fresco para lavar dos veces adicionales.
Después del último lavado PBS retire el sobrenadante y vuelva a suspender los túbulos seminíferos en cinco mililitros de PBS. A continuación, agregue 15 mililitros de 0,25%Trypsin EDTA a los túbulos. Coloque el tubo en un baño de agua Celsius de 37 grados e invierta suavemente cada dos minutos.
Después de cinco minutos evaluar la digestión enzimática de los túbulos a células individuales bajo el microscopio con 10 microlitros de muestra en una placa de cultivo de tejido. Cada dos minutos coloque la muestra bajo el microscopio para observar. Si en su mayoría se pueden detectar células individuales detener la reacción con cinco mililitros de FBS y filtrar a través de una malla de 70 micras y luego a través de una malla de 40 micras.
Centrifugar las células individuales a 500 veces G con roturas a 25 grados celsius durante cinco minutos. Re-suspender en 50 mililitros de medio de enriquecimiento, y contar el número de células viables utilizando un hemocicómetro. Transfiera 20 millones de esta población celular inicial a cada uno de dos platos de Petri ultrabajos de unión de 100 milímetros e incubar en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono y 21% de oxígeno durante dos días.
Cede 20 a 25 millones de células de la población celular inicial restante por plato de cultivo de tejido de 100 milímetros en un volumen total de ocho mililitros de medio de enriquecimiento. Coloque el plato en una incubadora y después de 1,5 horas asegúrese de que la mayoría de las células de Sertoli estén unidas a la placa. Incline ligeramente dos placas para recoger y combinar los sobrenadantes en una nueva placa de 100 milímetros y colóquela de nuevo en la incubadora.
Después de una hora, de nuevo combinar los sobrenadantes de dos placas a una nueva placa de 100 milímetros. Vuelva a colocar las placas en la incubadora durante la noche. Luego recoge las células germinales enriquecidas en dos fracciones, fracción no adherente y fracción ligeramente adherente.
Recoja el sobrenadante como la fracción no adherente. Para la fracción ligeramente adherente lavar las placas suavemente con PBS y tratar con dos mililitros de uno a 20 dilución de 0.25%Trypsin EDTA durante cinco minutos a temperatura ambiente. Detenga la reacción añadiendo dos mililitros de medio de enriquecimiento y recoja en el tubo de fracción no adherente.
Combine la preparación celular inicial y las células germinales enriquecidas en un tubo para obtener una preparación celular de trabajo que contenga 25%células germinales. Centrifugar a 500 veces G con roturas a 25 grados centígrados durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en 20 mililitros de medio de formación de organoides para alcanzar una concentración de 2,4 millones de células por mililitro.
En un nuevo tubo añadir un mililitro de la solución que contiene las células. Añadir 0,5 mililitros de solución de enjuague de surfactantes a cada pozo en una placa de micro pozo. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas en el pozo.
Para eliminar las burbujas de aire centrifugar la placa a 2.000 veces G con roturas a 25 grados centígrados durante dos minutos. Observe la placa bajo un microscopio invertido de bajo aumento para verificar que las burbujas se han eliminado de los micro pozos. Cubra la placa con una tapa e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Una vez finalizado el tratamiento, retire la solución de enjuague y lave inmediatamente la placa con agua estéril o PBS. Añadir 0,5 mililitros de medio de formación de organoides a cada pozo y centrifugar a 2.000 veces G con roturas a 25 grados Centígrados durante dos minutos para eliminar las burbujas de aire atrapadas. Observe el pozo bajo un microscopio invertido de bajo aumento para verificar que las burbujas de aire han sido eliminadas.
Agregue 0,5 mililitros de la suspensión de la célula de trabajo y mezcle suavemente en pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar a 500 veces G con roturas a 25 grados centígrados durante cinco minutos. Utilice un microscopio invertido para verificar que las células se han agrupado dentro de los micro pozos.
Transfiera el plato a una incubadora de cultivo celular y cultivo durante cinco días. Cambia la mitad del medio cada dos días. Para recuperar los organoides utilice una pipeta de boca ancha para pipetear suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo.
Esto permite que los organoides salgan de los micro pozos. Recoger los organoides, fijar y realizar inmunocitoquímica para marcador de células germinales, marcador de células sertoli, marcador de células mioides peritubular y marcador celular Leydig y visualizar bajo un microscopio confocal. En este estudio, células aisladas de testículos porcinos de una semana de edad que se cultivaron en micro pozos autoorganizados en esferoides con compartimentos exteriores e interiores delineados y distintos.
Los dos compartimentos estaban separados por una membrana de sótano positiva de colágeno IV. Las células Sertoli positivas GATA4 y las células germinales positivas UCHL1 estaban en el compartimento exterior de la membrana del sótano. las células mioides peri-tubulares positivas aSMA se localizaron a lo largo del interior de la membrana del sótano, mientras que las células positivas de Leydig CYP450 estaban en el centro del intersticio.
Esta estructura es similar a las condiciones de In Situ, donde las células de Leydig, células mioides peri-tubulares, se encuentran en el intersticio, en el compartimento intersticial y las células germinales, las células de Sertoli se encuentran en el epitelio semidifero. Es importante asegurarse de que las células que se utilizan para generar organoides tienen una calidad óptima. Se debe prestar una atención cuidadosa durante la etapa de tripsinación de la digestión enzimática.
Después de este procedimiento, los organoides se pueden cultivar a largo plazo para estudiar la diferenciación de células germinales o analizar la expresión génica y las proteínas u hormonas secretadas. La capacidad de crear organoides con asociaciones celulares específicas de testículos proporciona un nuevo sistema in vitro para estudiar interacciones células celulares importantes para el desarrollo de testículos y la función de células germinales.
