La vitrificación se maneja típicamente por la toxicidad de los agentes crioprotectores. Y se vuelve a insertar en muestras pequeñas que se pueden enfriar rápidamente. Este protocolo permite la vitrificación de grandes cantidades celulares mientras se utiliza una baja concentración de CPA durante la pre-incubación.
Utilizando una deshidratación osmótica rápida, el CPA entre bodegas baja se concentra en el dispositivo líquido justo antes de la vitrificación. Esto elimina la necesidad de concentraciones de CPA tóxicas totalmente equilibradas. La vitrificación de gotas a granel puede proporcionar hepatocitos viables y metabólicamente activos para el uso de trasplante de hepatocitos y dispositivos hepáticos bio-artificiales que actualmente se ven obstaculizados por resultados inadecuados después de la criopreservación.
Este método puede adaptarse potencialmente para la vitrificación de otros tipos de células que necesitan ser crio-conservados en grandes cantidades; tales como productos sanguíneos o células madre entre otros. Para empezar, hacer la solución de vitrificación 1 mediante la adición de 40 miligramos de BSA a 17.0 mililitros de la solución de la Universidad de Wisconsin. Utilice un filtro de 0,22 micrómetros para filtrar la solución estéril y almacenar a cuatro grados centígrados.
Haga la solución de vitrificación 2 como se describe en el protocolo. Y lo filtra estéril a través de un filtro de 0,22 micrómetros. Cargue 3,5 mililitros de solución V2 filtrada estérilmente en una jeringa de tres mililitros y guárdelo a cuatro grados centígrados.
Para preparar el aparato de vitrificación de gotas a granel, primero, corte a lo largo de un lado de las agujas de mezcla de la manga gris exterior. Doble el manguito abierto para retirarlo de la aguja de mezcla. A continuación, corte la aguja de mezcla a una longitud de 20 milímetros e inserte su salida de corte en una aguja de inyección de calibre 20.
Deslice dos secciones de tubo de silicio de 25 milímetros sobre las entradas de la aguja de mezcla. Y asegurar su posición con pegamento. Esterilice este conjunto mediante autoclaves.
Llene un matraz estéril Dewar con nitrógeno líquido. Y esterilizar el exterior con isopropanol antes de colocarlo en una capucha de cultivo de células de flujo Laminer estéril. Asegúrese de usar el equipo de protección personal adecuado, ya que el nitrógeno líquido puede causar quemaduras graves.
Para crear el dispositivo de recogida de gotas, inserte un embudo con el mismo diámetro exterior que el diámetro interior del Dewar, en un tubo cónico de 50 mililitros. Usando fórceps grandes, presione lentamente el dispositivo de recolección de gotas hacia abajo en el nitrógeno líquido en su posición vertical final. Asegúrese de que el tubo cónico descansa en posición vertical en la parte inferior del Dewar.
Y el nivel de nitrógeno líquido es un centímetro más bajo que el borde del embudo. Para montar una bomba de jeringa en una posición vertical en la pared de la campana de cultivo celular, ate una cuerda de los pies de la bomba de jeringa a los tornillos que sobresalen de la pared de la campana de cultivo celular. A continuación, coloque el nitrógeno líquido Dewar con el dispositivo de recogida de gotas debajo de la bomba de jeringa montada verticalmente.
Después de obtener hepatocitos de rata recién aislados, cuente la concentración de stock por exclusión azul de tres-pan. Y transferir 40 millones de hepatocitos viables a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar los hepatocitos a 50 veces G durante cinco minutos sin rotura.
Aspirar al sobrenadante. Re-suspender los hepatocitos en 3,4 mililitros de solución V1. E incubar sobre hielo durante tres minutos.
A continuación, agregue 150 microlitros de DMSO y 150 microlitros de EG;mezcle suavemente e incicle sobre hielo de nuevo durante tres minutos. Añadir 150 microlitros de DMSO y 150 microlitros de EG a los hepatocitos de nuevo y mezclar suavemente. Cargue 3,5 mililitros de esta mezcla en una jeringa de tres mililitros.
Inserte la jeringa con hepatocitos preperci incubados y la jeringa con solución V2 en el adaptador de la bomba de la jeringa. Conecte dos adaptadores de púas de manguera Luer Lock hembra a las jeringas. Y deslice el tubo de silicio del conjunto de la aguja de mezcla sobre los accesorios de la púa.
Coloque todo este conjunto en la bomba de la jeringa. Tres minutos después de la última edición de DMSO y EG a los hepatocitos, encienda la bomba a dos mililitros por minuto. Después de que todos los hepatocitos se han añadido al nitrógeno líquido detener la bomba.
Con una aguja de calibre 20, perfore 10 pequeños agujeros en la tapa de un tubo cónico de 50 mililitros. Y envuelva el exterior de la tapa con una película flexible, creando una válvula que permitirá escapar de la evaporación del nitrógeno líquido sobrante. Para recoger las gotas de hepatocito vitrificados, primero retire el embudo del Dewar con nitrógeno líquido.
A continuación, con fórceps largos, saque el tubo cónico que contiene las gotas del nitrógeno líquido, y vierta lentamente el exceso de nitrógeno líquido del tubo cónico. Cierre el tubo cónico con la tapa perforada y luego coloque directamente el tubo cónico cerrado con gotas de hepatocito vitrificos en el Dewar con nitrógeno líquido. Finalmente, transfiera el tubo cónico del nitrógeno líquido a una criootada de nitrógeno líquido.
Después de hacer la solución de recalentamiento con sacarosa y medios de cultivo de hepatocitos DMEM, utilice un filtro de 0,22 micrómetros para filtrarlo estérilmente. Luego califi córtelo a 37 grados centígrados. Para recalentar los hepatocitos eliminar el tubo cónico con hepatocitos vitrificados de la criootank y transportarlo en un nitrógeno líquido Dewar a la campana de la subcultura.
Afloje ligeramente la tapa y vuelva a colocar el tubo cónico en el nitrógeno líquido. Trabajando rápidamente, agregue todas las gotas de hepatocitos vitrificados a un vaso vacío, luego agregue rápidamente 100 mililitros de solución de recalentamiento caliente de 37 grados Celsius mientras se agita durante 10 segundos. Cuando las gotas se eliminan de nitrógeno líquido dentro de la est congelación se produce en cuestión de segundos si las gotas no se vuelven a calentar rápidamente.
Por lo tanto, es fundamental añadir directamente el medio de recalentamiento a las gotas mientras se agita. Divida la solución de recalentamiento con hepatocitos en dos tubos cónicos de 50 mililitros. Centrifugar los tubos durante dos minutos a 100 veces G a cuatro grados centígrados sin rotura.
Aspirar los sobrenadantes para dejar un volumen total de 12,5 mililitros utilizando la marca de graduación del tubo como referencia. Para diluir la solución de recalentamiento al 50%añadir 12,5 mililitros de DMEM helado por tubo cónico. Re-suspender e incubar sobre hielo durante tres minutos.
Para diluir la solución de recalentamiento al 25%añadir 25 mililitros de DMEM helado por tubo cónico. Después de centrifugar durante cinco minutos a 50 veces G a cuatro grados centígrados sin rotura, aspirar el sobrenadante y volver a suspender los hepatocitos en dos mililitros del medio de cultivo deseado. Cuando se mide mediante pruebas de exclusión azul tri-pan, que determina la integridad de la membrana, la vitrificación de gotas a granel dio lugar a una viabilidad directa de hepatocitos después de la preservación del 79%Esto fue significativamente mayor que la viabilidad del 68% después de la criopreservación optimizada clásica.
El rendimiento de la vitrificación de gotas a granel fue del 56%, que era un 10% más alto y más consistente que la criopreservación clásica. Usando el ensayo de metabolización de pre-pegamento en cultivos universitarios y sándwiches a largo plazo, la actividad metabólica en los hepatocitos se midió para ser significativamente mayor después de la vitrificación de gotas a granel después de la criopreservación clásica. La síntesis de albúmina, como el parámetro más utilizado de la función sintética de los hepatocitos, fue mayor por casi dos veces después de la vitrificación de gotas a granel, luego después de la criopreservación clásica.
La producción de urea se utilizó para medir la función de desintoxicación de hepatocitos en un cultivo de una semana. En los hepatocitos vitrificos de gotas a granel, la producción de urea fue significativamente mayor que la de los hepatocitos clásicos criopreserve. Para obtener resultados consistentes después de la vitrificación de gotas a granel, es importante seguir exactamente el tiempo durante la pre-incubación de CPA y el recalentamiento como se detalla en este protocolo.
Después de recalentar las gotas de hepatocito vitrificados, terminará con una mejor suspensión de tamaño que, por lo tanto, se puede utilizar de todas las mismas maneras que si estuvieran recién aisladas. Como método de preservación mejorado, la vitrificación de gotas a granel puede aumentar la disponibilidad pri-ma para aplicaciones clínicas y de investigación.
