Contamos con protocolos estandarizados de preparación de muestras para embriones de tortuga pintados por imágenes, cáscaras de huevo rígidas y cultivos de hongos utilizando microscopía electrónica de barrido. Estos métodos integrales utilizan alteraciones sutiles en los protocolos conocidos para procesar tres tejidos delicados permitiendo la diferenciación entre las estructuras originales y el procesamiento de los artefactos. Demostrando el procedimiento conmigo será Jessica Gibbons, una estudiante graduada de mi laboratorio.
Antes de recoger los huevos de tortuga de un sitio de campo durante la temporada de anidación, haga de cuatro a seis agujeros de 0,25 centímetros a lo largo de los lados de las cajas de plástico y en sus tapas para permitir la aireación. Antes de llenar las cajas con una mezcla húmeda de vermiculita y mezcla de lecho de musgo de turba en una proporción de uno a uno. En el lugar de anidación, retire suavemente el suelo para descubrir los huevos y limpie la superficie de cada huevo de tortuga con una tintura de yodo diluida para proteger contra la contaminación microbiana durante la incubación.
Coloque un máximo de ocho a nueve huevos por caja en la misma orientación y alineación que se colocaron, manteniendo las garras individuales separadas entre sí. Una vez recogidos todos los huevos, entierre manualmente la mitad de los huevos en la ropa de cama y coloque las cajas tapadas dentro de una incubadora de 30 grados Celsius durante 10 a 17 días para obtener embriones embrionarios 12, 13 y 18 respectivamente. Agregue agua destilada para humedecer parcialmente el medio de la cama cada dos días para evitar la deshidratación y para mantener el nivel de humedad para el desarrollo normal de embriones.
En la etapa apropiada de desarrollo, utilice tijeras puntiagudas para hacer un corte en un lado de la cáscara de huevo dorsal y la membrana de la yema juntos, vertical al eje largo del huevo. A continuación, corta el otro lado del óvulo a lo largo del eje corto, y usa fórceps para abrir la pieza extirpada con el lado del embrión hacia arriba. Corte el otro lado lateral de la cáscara de huevo y coloque la pieza de cáscara extirpada en PBS.
Usando un estereomicroscopio y fórceps, pela el embrión y la membrana de la yema de la cáscara de huevo. Utilice los fórceps y micro tijeras para eliminar las membranas embrionarias adicionales, y utilice una cuchara embrionaria para transferir el embrión a un plato Petri de PBS fresco. Después de lavar la sangre y la yema, coloque hasta tres embriones por pozo de una placa de 12 pozos, que contiene un 4% de paraformaldehído a cuatro grados centígrados durante dos o tres días.
Cuando las muestras parezcan blancas, utilice inserciones de poliestireno con fondos de malla de poliéster para enjuagar los embriones con tres lavados de cinco minutos en PBS fresco por lavado. Después del último lavado, deshidratar las muestras en una serie ascendente de etanol durante una hora por concentración. Después de la segunda inmersión en etanol, seque los embriones en una serie de concentraciones de HMDS a etanol durante 20 minutos por inmersión con los platos Petri parcialmente cubiertos.
A continuación, coloque los embriones en una solución final 100%HMDS, total o parcialmente cubierto en una campana de humo durante la noche. El secado lento aumentando gradualmente la concentración de HDMS a etanol es importante para revelar una excelente estructura superficial en los embriones. A la mañana siguiente, utilice cinta conductora de carbono de doble palo para montar cuidadosamente las muestras completamente secas en un talón de pasador de aluminio estándar.
Cuando todas las muestras hayan sido montadas, introduzca las muestras en la cámara de la recubridora para recubrir los especímenes con una película muy delgada de oro durante 60 a 120 segundos a una boquilla de 35 miliamperios. A continuación, fije firmemente los tornillos de fijación para montar los talones en las placas de vertido correspondientes. Utilice la herramienta de intercambio de muestras para transferir el portacuchillas a la cámara de muestra del microscopio electrónico de barrido para obtener imágenes.
Para preparar cáscaras de huevo para escanear la microscopía electrónica, coloque las cáscaras de huevo en agua destilada durante al menos una hora después de la cosecha del embrión para eliminar cualquier contaminación por yema o albúmina. A continuación, seque al aire las cáscaras de huevo limpias en delicadas toallitas antiestáticas en la campana de humo durante la noche. Almacene las cáscaras de huevo secas en botellas limpias de muestras, etiquetadas por número y etapa embrionaria.
A continuación, monte, cubra la capa e imagen de los especímenes de cáscara de huevo como se acaba de demostrar para los embriones. Para establecer cultivos de hongos deslizantes, utilice un bisturí estéril para cortar bloques de medio a tres cuartos de pulgada de agar dextrosa de patata sólida, y coloque los bloques en diapositivas de microscopio de vidrio individuales. Coloque palillos de dientes estériles en la parte inferior de los platos limpios de Petri para elevar los portaobjetos de ellos para crear tensión superficial entre la placa y el portaobjetos.
Coloque cada diapositiva sobre los palillos de dientes en el plato de Petri. A continuación, utilice un bucle estéril para transferir hongos desde el inóculo de la muestra a cada uno de los cuatro lados laterales de un bloque de agar. Agregue unas gotas de agua destilada estéril al plato Petri alrededor del portaobjetos para asegurar la humedad de los hongos en crecimiento.
Selle parcialmente la placa con película de parafina y coloque la placa en la incubadora de 30 grados Celsius durante el período de incubación adecuado para las especies de hongos. Al final de la incubación, retire el portaobjetos de la placa Petri y utilice fórceps estériles para transferir el bloque de agar bien adherido del portaobjetos a un recipiente de 3%glutaraldehído para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, deshidrate las muestras en una serie ascendente de etanol durante 15 minutos por concentración.
Después de la inmersión del 90%, procesar las muestras para la deshidratación final con dos cambios de 30 minutos en 100% etanol para asegurar una saturación completa antes de colocar las muestras deshidratadas en la cámara del aparato de secado de punto crítico. Selle la cámara y abra las válvulas para permitir que el dióxido de carbono líquido se desahoge y deje que el etanol se ventile hasta que el dióxido de carbono líquido llene completamente la cámara. A continuación, selle y caliente lentamente la cámara para lograr un punto crítico cuando la presión de la cámara supere las 1.000 libras de presión por pulgada cuadrada, la temperatura supere los 31 grados centígrados y el espacio líquido y gas de dióxido de carbono está en equilibrio.
A continuación, drene lentamente el dióxido de carbono de la cámara y la muestra como un gas, para evitar cualquier efecto de tensión superficial en la muestra, y monte, placa e imagen de las muestras de hongos como se demuestra. Una vista lateral del micrográfico electrónico de barrido de un embrión de tortuga pintado en etapa 12 revela cómo la prominencia maxilar se extiende más allá del mandibular y limita mediamente un pozo nasal bien marcado. También se pueden observar cinco arcos faríngeos.
En un embrión de etapa 15, las somitas recién formadas son visibles en la región posterior de la cola del embrión, y los cogollos de la extremidad delantera apuntan más cortally que ventralmente. Un crecimiento bien definido de una cresta de caparazón también se puede visualizar a lo largo de toda la región del flanco interlimb del embrión. En la etapa 18, se ha formado un hocico corto y débilmente proyectado con un pico inferior ligeramente volcó con un gancho terminal que cabe en la muesca central del pico superior.
La mandíbula superior exhibe una apariencia muesca, y un pequeño diente de huevo se puede ver formando en la punta de la mandíbula superior. El análisis ultraestructural de la cáscara de huevo Chrysemys picta y la membrana de la cáscara mediante la microscopía electrónica de barrido, revela una capa externa de cáscara de huevo calcarinus, firmemente unida a la membrana filamentosa interna de la cáscara. La superficie exterior de la cáscara de huevo consiste en unidades de cáscara mineralizadas bien distinguidas hechas de nódulos esféricos globulares dispuestos en grupos y entre unidades adyacentes de concha, con una concentración de pequeñas depresiones redondeadas o poros de varios tamaños.
Las metodologías comunes no se pueden generalizar para todas las muestras biológicas para lograr una calidad de imagen decente utilizando SEM. Las alteraciones únicas como se ha demostrado son esenciales para un tipo de tejido específico. El método químico y de secado de aire también podría utilizarse para otras muestras orgánicas, y la técnica de cultivo de deslizamiento de acoplamiento podría utilizarse para todos los cultivos microbianos blandos y robustos.
