El ensayo de doble regla de ADN puede proporcionar información mecanicista para la translocación ribosoma y sondear otros desplazamientos de ácido nucleico. Nuestro ensayo de doble regla de ADN es actualmente el único método que puede sondear objetivamente los lados de entrada y salida del ARNm en los complejos ribosomas con resolución de un solo nucleótido. También se aplican métodos similares para medir la fuerza de unión al ADN y la selectividad de los fármacos quimioterápicas.
La demostración visual del método es una buena oportunidad para mostrar intuitivamente las ventajas de nuestra técnica y ayudar a otros investigadores a desarrollarlo aún más en más aplicaciones. Para empezar, hacer una muestra de plástico bien con una tira de estireno perforando un cubo en el centro con dimensiones de cuatro milímetros por tres milímetros por dos milímetros. Luego, usando epoxi, pegue un pedazo de vidrio recubierto de biotina, de aproximadamente cinco milímetros de largo, a la superficie inferior.
Añadir 20 microlitros de 0,25 miligramos por mililitro de solución acuosa de estreptavidina en el pozo de la muestra, e incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, enjuague bien la muestra dos veces con el tampón TAM10. Para inmovilizar los complejos ribosomas sin antibióticos, primero retire el tampón del pozo de muestra y agregue 20 microlitros de 0.1 micromolar MF-Pre o MF-Post complejo ribosoma en el pozo de la muestra.
Incubar a 37 grados centígrados durante una hora, y luego enjuagar una vez con tampón TAM10. El complejo ribosoma ahora se une con la estreptavidina en la superficie a través de la biotina de cinco primos en el ARNm. Para el experimento con antibióticos, incuba nueve microlitros del complejo MF-Pre con un microlitro de cuatro neomicina milimétrica, 37 grados Celsius durante 10 minutos.
A continuación, combinar en un tubo 0,6 microlitros de 60 micromolar EFG, 0,8 microlitros de 100 micromolar GTP, 0,8 microlitros de 100 militrolarES PEP, 0,3 microlitros de 1,3 miligramos por mililitro piruvato quinasa, 6,43 microlitros TAM10, tampón y un microlitor de cinco ácidos fusídicos mililares. Incubar a 37 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, combine las dos mezclas e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos adicionales.
Llevar a cabo los otros experimentos con antibióticos de forma similar, con concentraciones de 0,2 emicina mililar, 0,4 ehigromicina mililitrosa B y 0,25 ácidos fusídicos mililares. Para el estudio de cambio de marco, repita la incubación para los complejos NMF-Pre que implican el motivo resbaladizo, U6A. Incluya antibióticos de ácido fusídico más neomicina.
Se ha necesario tiempo suficiente para garantizar la finalización del proceso de hibridación. También se recomienda utilizar el tampón TAM10 con un cloruro de sodio lunar real para mantener un sistema homosteady. Después de la incubación, retire el tampón del pozo de muestra.
Añadir 20 microlitros de una cadena de ADN de sondeo biotinilada micromolar e incubar a temperatura ambiente durante la noche. Por la mañana, enjuague el dúplex de ADN/ARM formado una vez con tampón TAM10. Retire el búfer del pozo de muestra.
A continuación, agregue 20 microlitros de 0,5 miligramos por mililitro recubierto de estreptavidina en el pozo de muestra, e incubar a temperatura ambiente durante dos horas. Después de eso, inserte cuidadosamente la muestra bien en un soporte, y colóquela en una centrífuga para eliminar las partículas magnéticas libres de la superficie a 84 veces g durante cinco minutos. Enciende el láser.
A continuación, pulse el botón de encendido. Ajuste la sensibilidad a 500 milivoltios y espere unas dos horas para calentar y estabilizar el magnetómetro atómico. Para configurar el magnetómetro atómico, ejecute el software de control de instrumentos y configure el modo de movimiento del motor en Ruido y la posición predeterminada a cero.
Pulse Bloquear en el panel frontal. Ajuste la sensibilidad a 200 milivoltios. Ajuste la corriente y el voltaje del láser, y encuentre el pico de resonancia adecuado y el nivel de señal a ruido para la mejor resolución de señal.
Pulse Barrido en el panel frontal. Asegúrese de que la relación amplitud-ancho es superior a 0,5 y que el valor de fase es menor que cinco grados con una anchura inferior a 170 hercios. Conecte la salida de otro amplificador de bloqueo SR530 a la retroalimentación del láser para bloquear su frecuencia.
Conecte el generador de funciones ATF20B para introducir una onda cuadrada de 500 milivoltios pico a pico, 100 milivoltios como la señal de referencia para convertir la corriente a señal magnética. A continuación, desenchufe el generador de funciones. Configure el modo de movimiento del motor en bidireccional y la posición predeterminada a 260 milímetros.
Compruebe el estado del controlador de temperatura, para asegurarse de que la temperatura está a aproximadamente 37 grados centígrados, del sensor atómico. Compruebe la estabilidad de todo el sistema dos veces ejecutando directamente el programa sin cargar muestras para medir las señales del soporte de muestra vacío. Para magnetizar las muestras, utilice suavemente pinzas para sacar la muestra del soporte y colóquela en la etapa de magnetización durante dos minutos.
A continuación, vuelva a colocar la muestra en el portacuchillas y centrifugar a 335,4 g durante 20 minutos. Retire las partículas magnéticas no específicamente unidas. A continuación, cargue la muestra en el motor con pinzas.
Haga clic en Bloquear en el panel frontal para ejecutar el programa. Mientras tanto, utilice pinzas para cargar otra muestra en el soporte y colóquela en la centrífuga. Haga que el lado de vidrio recubierto se enfrente al centro de la centrífuga e inicie la centrifugación a 335,4 veces g durante cuatro minutos.
Cuando el motor vuelva a cero, después de aproximadamente cinco minutos, haga clic en Guardar en el panel frontal. Utilice cuidadosamente pinzas para transferir una muestra del motor al soporte de la centrífuga. Aplique una fuerza más fuerte aumentando la velocidad centrífuga en 100 rpm o un tamaño de paso similar.
Cambie la muestra por la centrífuga. Procesar alternativamente para aumentar gradualmente la fuerza cada vez. Se obtiene un espectro de fuerza completo después de 10 a 12 puntos de datos.
Cuando terminen todos los experimentos planificados, apague el equipo y continúe en el orden opuesto mientras se encendió. Retire las muestras del soporte y sumerjalas en etanol para su limpieza y uso futuro. Limpie el soporte de muestra con acetona en caso de contaminación magnética del cordón.
En este protocolo, el complejo ribosoma fue inmovilizado en la superficie, a través del extremo de cinco primos del ARNm, y hizo que el lado de cinco y tres primos fuera fácilmente accesible para las reglas de ADN de sondeo. Cuando el vinculador para el lado de cinco primos tenía más de 50 timinas, se detectó una señal magnética fuerte, lo que indica una formación exitosa de dúplex de ADN/ARNm. Al variar el número de nucleótidos en el ADN, se logró la correlación de la fuerza de disociación con la longitud dúplex para los lados de tres y cinco primos, respectivamente.
Los resultados de la translocación normal de MF-Pre a MF-Post, en ausencia de antibióticos, muestran que el ribosoma se movió por tres nucleótidos hacia el extremo triple en ambos lados. MF-Pre transportó un fMet-tRNA y un ARN-TRNA de vencilaco en los sitios P y A, respectivamente, mientras que MF-Post transportó fMet-tRNA y fenilalanina-tRNA en los sitios E y P, respectivamente, con un sitio A vacante. Sin embargo, cuando ambos ácido fusídico y antibióticos adiomicina estaban presentes, el ribosoma movido por sólo un nucleótido en el lado de cinco primos, pero dos nucleótidos en el lado de tres primos.
Después de lavar los antibióticos, se produjo la translocación normal, como lo demuestran tres movimientos de nucleótidos de los lados de cinco y tres primos. Al magnetizar la muestra, la superficie recubierta debe acercarse y dejar el imán verticalmente. Y la eliminación de las partículas magnéticas no ligadas específicamente es muy importante para la precisión y la calidad de los datos.
Nuestra técnica proporciona una alta resolución y una forma generalmente aplicable de investigar el desplazamiento molecular del ácido nucleico que se encuentra ampliamente en la biología molecular.
