La técnica de perfilado de ribosomas, también llamada RIBO-seq, es actualmente la herramienta más eficaz para estudiar el proceso de síntesis de proteínas in vivo. La ventaja de este método es su capacidad para monitorear la traducción mediante el mapeo preciso de la posición y el número de ribosomas. RIBO-seq se basa en el hecho de que el ribosoma, al unirse a la molécula de ARNm, protege el fragmento enterrado de la transcripción sobre la digestión de la ribonucleasa.
Los fragmentos obtenidos, llamados huellas ribosómicas, pueden ser secuenciados y mapeados en la transcripción de la que se originaron, lo que resulta en la determinación de la posición exacta de los ribosomas. Simultáneamente al RIBO-seq, la secuenciación total del mRNA de alto rendimiento se realiza para proporcionar un punto de referencia y para permitir la comparación de datos de RIBO-seq y de RNA-seq durante el análisis de datos. Antes de la recolección de células, opcionalmente puede agregar cloranfenicol al cultivo bacteriano, a la concentración final de 100 microgramos por mililitro, para inhibir la traducción.
Incubar el cultivo con el antibiótico durante un minuto. Este paso es importante si la cosecha tarda más de lo habitual, ya que la inhibición de la traducción permite extender el tiempo de recolección de la muestra. Recoja las muestras con un sistema de filtración precalentado.
Usted puede introducir temblores con el fin de imitar las condiciones de crecimiento. Deje de filtrar cuando todos los medios hayan pasado a través de la membrana, pero no permita que el filtro se seque por completo. Recoja los pellets bacterianos raspando rápidamente las células del disco del filtro usando una cápula precalentada y desinfectada.
Coloque inmediatamente toda la cápula con las células cosechadas en un tubo de 50 mililitros lleno de nitrógeno líquido. El pellet cosechado debe estar completamente cubierto de nitrógeno líquido. Deje que el pellet se congele a fondo y desaloje las células congeladas usando una cápula previamente enfriada.
Cierre la tapa y asegúrese de que esté perforada. Esto es importante, ya que el nitrógeno líquido puede hacer que los contenedores cerrados exploten debido al cambio de presión tras la evaporación. Prepare GMPP, el hisopo de LA DNA, y los tubos frescos de Eppendorf dedicados para la lisisa.
Prepare el tampón de lisis con la adición de cloranfenicol si es necesario. Asigne 500 microlitros de tampón de lisis por muestra en tubos Eppendorf separados y colóquelos en hielo. Descontaminar mortero y pestle con un desinfectante de laboratorio y etanol al 70%.
Enfríe el mortero y el pestle vertiendo nitrógeno líquido en el mortero. Transfiera el pellet bacteriano congelado a un mortero preenfriado y muele en polvo. Agregue aproximadamente un volumen de óxido de aluminio y continúe moliendo.
Mantenga el mortero, el pestle y las células enfriando vertiendo nitrógeno líquido cuando sea necesario, para no dejar que el contenido del mortero se descongele. Justo antes de usar, agregue GMPPNP y el hisopo de ADN en la alícuota del tampón de lisis. Transfiera la solución al mortero y continúe moliendo.
Deje que la lisasa se descongele lentamente mientras se muele. Cuando la lisasa se descongele por completo, transfiera la mezcla al tubo eppendorf pre-refrigerado y regrese al hielo. Centrífuga lisasa a 20, 0000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Transfiera sobrenadantes a tubos Eppendorf frescos y preenfriados y colóquelos en hielo. Mida la concentración de ARN en cada muestra diluida con NanoDrop. Divida cada lysate en dos porciones, 0.5 a 1 miligramo de ARN para RIBO-seq, y el resto para RNA-seq.
A un miligramo del ARN, agregue 3.8 microlitros de MNase en Tris pH 8, y repáguelo con tampón de lisis hasta el volumen total de 500 microlitros. Incubar a 25 grados centígrados, 300 rondas por minuto, durante 45 minutos. Cuando termine la incubación, limpie las muestras con un kit de limpieza de ARN disponible en el comercio.
Prepare un gel de TBE de poliacrilamida al 15% con ocho molares de urea, y colóquelo en un tanque con tampón de TBE. Pre-ejecutar durante un mínimo de 10 minutos a un voltaje constante de 200 voltios. Mezcle las muestras con el tampón de muestras de TBE-Urea.
Desnaturalizar a 95 grados centígrados durante un minuto y colocarlos inmediatamente sobre hielo. Lave la urea inyectando tampón de TBE en los pocillos de gel con una jeringa. Cargue las muestras, dejando un espacio de pozo entre ellas para separar cada muestra y evitar la contaminación cruzada.
Utilice 29 oligos de nucleótidos de largo, y una mezcla de 26 y 32 oligos de nucleótidos largos como marcadores. Ejecute la electroforesis a un voltaje constante de 180 voltios. Prepare el tampón estéril para la incubación durante la noche.
Una vez finalizada la electroforesis, manche el gel con SYBR Gold. Elimine los fragmentos del gel entre 26 y 32 nucleótidos con una aguja estéril o una cuchilla de afeitar, y coloque los fragmentos de gel en tubos Eppendorf separados. Cambie la aguja o la cuchilla de afeitar entre las muestras.
Agregue 200 microlitros de tampón de incubación durante la noche a cada Eppendorf e incube las muestras a 10 grados Celsius, 1000 rondas por minuto, durante la noche. Al día siguiente, limpie las muestras con un kit de limpieza de ARN y elérelas en 18 microlitros de agua libre de nucleasa. Las huellas ribosómicas obtenidas están listas para la preparación de la biblioteca.
Realice el agotamiento ribosómico del ARN para las muestras para el ARN-seq usando un kit comercialmente-disponible. A continuación, limpie las muestras con el kit de limpieza de ARN. Realice la hidrólisis alcalina de la siguiente manera;prepare el tampón de hidrólisis alcalina, agregue un volumen del tampón a un volumen de la muestra e incube a 95 grados Celsius durante 25 minutos.
Añadir cinco microlitros de 3 molares de acetato de sodio pH 5,5 a cada muestra para detener la reacción. Limpie las muestras con un kit de limpieza de ARN y elérelas en 18 microlitros de agua libre de nucleasa. El ARN fragmentado aleatoriamente obtenido está listo para la preparación de la biblioteca.
Agregue 10 microlitros de tampón de reacción 10x y cinco microlitros de polinucleótido quinasa T4 a cada muestra. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora y media. Después de este tiempo, agregue tres microlitros de un ATP milimomolar e incube a 37 grados Celsius durante una hora.
A continuación, limpie las muestras con el kit de limpieza de ARN. Realice la preparación de la biblioteca utilizando el kit disponible comercialmente, de acuerdo con el protocolo proporcionado aquí. Realice PAGE usando gel de poliacrilamida al 6%.
Manche el gel con SYBR Gold. Suprimir fragmentos de gel que contienen las bibliotecas. Para muestras de ARN-seq, la biblioteca está entre 135 y 180 nucleótidos, y para RIBO-seq, entre 135 y 170 nucleótidos.
Use agujas estériles o cuchillas de afeitar y coloque los fragmentos de gel suprimidos en tubos Eppendorf separados. Recuerde cambiar la aguja o la cuchilla de afeitar entre las muestras. Agregue 100 microlitros de agua sin nucleasa a cada fragmento de gel extirpado.
E incubarlos a 10 grados centígrados, 450 rondas por minuto, durante la noche. Al día siguiente, limpie las muestras con un kit de limpieza de ADN. Las bibliotecas obtenidas están listas para el control de calidad y cantidad con alta sensibilidad, electroforesis de ADN en chip y luego para la secuenciación de próxima generación.
Las bibliotecas de ADNc resultantes presentan una cantidad y calidad adecuadas requeridas para la secuenciación de próxima generación, según lo verificado por la electroforesis de ADN en chip de alta sensibilidad. Las bandas y picos que representan las bibliotecas RIBO-seq son más estrechas y están mejor definidas, en comparación con esto que representa las bibliotecas de ARN-seq. De acuerdo con la electroforesis en chip, las bibliotecas tienen la lente esperada.
Los picos adicionales más cercanos a 200 pares de bases presentes en las bibliotecas RIBO-seq pueden indicar ribosomas en hibernación, huellas ribosómicas no completamente digeridas o artefactos, por ejemplo, ARNr, y se pueden descartar durante el análisis bioinformático cuando se recortan los datos obtenidos de la secuenciación y se filtra el ARNt de ARNr. La cantidad media de ADNc generada en la preparación de bibliotecas es de 32 nanogramos, lo que proporciona una cantidad suficiente de material necesario para la secuenciación de próxima generación. Después del control de calidad por electroforesis en chip, las bibliotecas se retiraron para la secuenciación de pares de bases individuales y 50 en una plataforma NextSeq 500 de Illumina.
El recorte de los adaptadores y las secuencias de mala calidad dieron como resultado de 25 a 47 millones de lecturas por muestra para muestras de ARN-seq, y de 25 a 50 millones de lecturas por muestra para muestras RIBO-seq. Los datos obtenidos fueron el control de calidad verificado con FastQC. Las muestras del ARN-seq y del RIBO-seq presentaron la calidad muy buena.
El mapeo de las bibliotecas preparadas de acuerdo con el protocolo descrito produjo de 2,4 a 9,6 millones de lecturas mapeadas de forma única por muestra para muestras de ARN-seq, y de 2,3 a 10,4 millones de lecturas mapeadas de forma única para muestras RIBO-seq. Los datos de RIBO-seq exhiben una periodicidad triplicada y un pico alto y estrecho, correspondiente a los ribosomas iniciadores y característico de las huellas ribosómicas, que no se observa en los datos de ARN-seq. Por otra parte, la gráfica que muestra los perfiles de cobertura promedio de huellas ribosómicas y fragmentos de ARNm en las secuencias de codificación revelan la mayor proporción de lecturas mapeadas a los CDS en el conjunto de datos RIBO-seq, como se esperaba.
La visualización de las huellas ribosómicas mapeadas mostró patrones muy similares en comparación con los resultados obtenidos del mismo experimento realizado de acuerdo con el procedimiento ribo-seq estándar, que incluye la recuperación de monosomas por ultracentrifugación de gradiente de sacarosa. Nuestro protocolo se ha utilizado para investigar la regulación de la traducción en varias condiciones de crecimiento, pero se puede aplicar para estudiar otros aspectos de la traducción, como la detección de sitios de iniciación a la traducción y nuevos genes de codificación de proteínas. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con nuestras directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo.
El protocolo que presentamos aquí es rápido, fácil y rentable, y se puede realizar con equipos de laboratorio estándar.
