El radioetiquetado de carbono-11 permite utilizar pequeños compuestos para la tomografía por emisión de positrones o PET sin cambiar la molécula. Esto es esencial para investigar los niveles de expresión del receptor. La ventaja del radioetiquetado de carbono-11 es que podemos utilizar PET para evaluar directamente la cinética de las fijaciones de SNAP hacia el receptor hormonal concentrado de melanina en tiempo real.
SNAP como antagonista del receptor de la hormona concentrante de melanina contribuirá a una mejor comprensión de este receptor y su asociación con condiciones metabólicas como la obesidad y la diabetes. Los transportadores de eflujo expresados en la barrera hematoencefálica pueden obstaculizar significativamente el uso de radiofármacos para la toma de imágenes de expresión de receptores centrales. Por lo tanto, es importante evaluar las trazas in vitro.
La radiosíntesis automatizada de SNAP es ampliamente aplicable a compuestos radiomarcados de bajo peso molecular con un grupo metilo fácilmente evaluable. Una vez establecido este procedimiento se puede adaptar para otros compuestos. La asistencia en la demostración serán las estudiantes senior de doctorado Sarah Pfaff y Theresa Balber.
Para comenzar la síntesis snap de carbono-11, configure un módulo de síntesis automatizado de carbono-11 limpio con los reactivos y materiales adecuados. Inicie el proceso de síntesis de SNAP en el módulo informático que comenzará con las comprobaciones y el acondicionamiento del sistema. Unos 30 a 40 minutos antes de que el módulo esté listo para la entrega de C-11, seleccione el objetivo de dióxido de carbono C-11 en el ciclotrón e inicie el haz a 65 microamperios.
Una vez que el módulo está listo para la entrega, cierre la ventana interior y la puerta exterior. Confirme que la trampa de CO2 se ha enfriado a por lo menos 40 grados Celsius y que la trampa de metano ha comenzado a enfriarse. Una vez que el ciclotrón ha producido alrededor de 120 gigabecquerels de C-11 CO2 haga clic en Aceptar en el software del módulo para abrir la ruta desde el objetivo a través de la trampa de CO2.
En la computadora de ciclotrón comience a entregar C-11 CO2 al módulo. Supervise la transferencia de actividad en el ordenador del módulo y asegúrese de que procede a la reducción de CO2 a metano después de tres minutos. Monitorear el proceso a medida que el metano resultante se enjuaga a la trampa de metano y se convierte en yoduro de metilo por circulación a través del horno de yodo.
Al final de la secuencia de conversión espere mientras los subproductos se vacían de la trampa de yoduro de metilo para agotarse y luego confirme que el reactor está listo para recibir actividad haciendo clic en Aceptar. Monitorear el sistema como el yoduro de metilo se libera de la trampa, se enjuaga a través del horno de triflato de metilo y atrapado en el reactor. Cuando la actividad en las mesetas del reactor confirma que el reventado está completo. Espere mientras la mezcla de reacción reacciona a 75 grados Centígrados durante tres minutos.
A continuación, monitoree el sistema mientras la mezcla de reacción se enfría a menos de 35 grados centígrados y se apaga con 1,5 mililitros de agua. Supervise el sistema a medida que la mezcla de reacción se carga en el bucle de inyección HPLC y se inyecta en la columna HPLC semi-preparatoria. Observe los rastros del detector UV y gamma mientras procede la cromatografía.
Cuando el pico del producto comience a aparecer manualmente, comience a recoger el producto en el matraz de recogida de fondo redondo en el módulo. Finalizar manualmente la recolección cuando la señal gamma cae por debajo de unos 400 recuentos por segundo. Observe el nivel de líquido en el matraz inferior redondo mientras el producto se carga en un cartucho de extracción de fase sólida bajo presión de helio.
Una vez que el matraz esté vacío y el líquido haya pasado a través del cartucho SPE, haga clic en Aceptar para comenzar a lavar los productos atrapados en el cartucho. A continuación, controle la actividad en el vial de recogida de productos, ya que el producto se eluye primero del cartucho en el vial y luego se diluye con una solución salina al 0,9%. Observe cómo la solución del producto se transfiere al vial del producto a través del filtro estéril bajo presión de helio.
Cuando la transferencia se haya completado, cierre la válvula de salida del producto. Cuando la radiosonda llega al vial del producto mide el rendimiento radiactivo absoluto. A continuación, utilice una jeringa con plomo blindado para transferir 100 microlitros del trazador a un pequeño vial para el control de calidad.
Lleve la muestra de control de calidad a un área de trabajo de control de calidad blindada. Extraiga 40 microlitros de la muestra de control de calidad en una jeringa hermética al gas, cárguelo en un instrumento HPLC preparado equipado con una columna analítica e inyecte el producto. Realice otras mediciones de control de calidad durante la ejecución de HPLC.
Una vez que la carrera de HPLC ha terminado integrar todos los picos en el cromatograma del detector de radiactividad para determinar si la pureza química de radio SNAP es mayor que 95%Integrar los picos en el cromatograma UV para determinar la pureza química del producto. Utilice el área bajo el pico del producto UV para calcular la actividad específica. Una vez confirmado el producto para cumplir con los requisitos de uso, suelte el trazador de radio al laboratorio de experimentos cinéticos en tiempo real.
Al menos 30 minutos antes del experimento lave el tipo silvestre preparado o las células trans infectadas con DPBS y agregue dos mililitros de medio de crecimiento sin suero. Para bloquear las células trans infectadas, agregue 0,98 microlitros de una solución de 20,4 milimolares de clorhidrato de verapamilo racémico en dimetilslfóxido. Incubar las células en un plano oblicuo durante 30 minutos.
A continuación, encienda el instrumento de ensayo en tiempo real y el ordenador asociado. Abra el software de control y elija un destino. Establezca el número de posiciones en dos, el tiempo de detección en tres segundos, el tiempo de retardo de detección en dos segundos y el nombre de la primera fase en línea de base.
Inserte la placa de cultivo celular en el soporte inclinado del dispositivo con el poste de la celda en la parte inferior. Asegúrese de que el polo celular esté cubierto en un medio de cultivo celular. Inicie una medición de fondo de 10 minutos y establezca el nombre de archivo y la ruta de acceso.
Establezca la escala de tiempo en minutos y la colección de nucleidos en carbono-11. Configure el gráfico para mostrar los datos de destino restados de fondo, destino y fondo. Una vez que el trazador de radio ha sido entregado y aprobado para su uso, tome una pequeña muestra para el ensayo.
Calcule el volumen necesario de solución de trazador de radio y prepare una pipeta. En el software de instrumentos, detenga la carrera y espere a que se detenga la rotación del plato. Abra la tapa del dispositivo, gire el soporte 90 grados a la izquierda, añada el trazador de radio con la pipeta preparada y devuelva el dispositivo a su posición inicial.
Cierre la tapa del dispositivo e reanude inmediatamente el experimento. Deje que el experimento se ejecute durante 20 minutos antes de finalizarlo. Procesar y analizar los datos para evaluar la captación de SNAP en las celdas.
Ahora el procedimiento se puede repetir para el plato de cultivo celular de control tratado con DMSO y la línea de celdas de tipo salvaje. Los ensayos cinéticos en tiempo real se realizaron con células de tipo salvaje no PGP que expresan, células que expresan PGP prebloqueadas con verapamilo como inhibidor de PGP y células PGP desbloqueadas. No se observó ninguna diferencia significativa entre las células no tratadas y las células tratadas con vehículos.
Carbon-11 SNAP se acumuló rápidamente en células de tipo salvaje mientras no se observó acumulación en células que expresan PGP. El bloqueo previo del transportador de eflujo PGP con verapamilo dio lugar a la acumulación de SNAP en las células PGP comparable a la de las células de tipo salvaje. En combinación con las mediciones cinéticas en tiempo real, esta configuración permite una amplia comprensión de la farmacocinética de los compuestos de bajo peso molecular y, por lo tanto, es muy importante para el desarrollo preclínica de radiofármacos.
El tiempo y la organización son los ingredientes principales para una radiosíntesis exitosa de carbono-11 con experimentos cinéticos posteriores en tiempo real, ya que la vida media del carbono-11 es de sólo 20 minutos. Debido a una corta vida media de carbono-11 muchas partes de este procedimiento se realizan simultáneamente. Es importante que todos los involucrados entiendan el alcance y el momento de su función.
Tanto la seguridad del producto como la protección contra la radiación son fundamentales para la preparación de radiofármacos. Todos los experimentos deben seguir lo más bajo que sea razonablemente alcanzable o el principio ALARA para limitar la exposición a la radiación del operador.
