El protocolo permite una función aislada rápida de pequeñas subpoblaciones de células dentro de islotes pancreáticos de Langerhans. Las ventajas de esta técnica incluyen la naturaleza en tiempo real y el alto poder estadístico, y por lo tanto la alta reproducibilidad, de los datos adquiridos. Para inmovilizar los islotes para la toma de imágenes, ensamble una cámara de imágenes para un microscopio invertido y coloque un resbalón de cubierta de vidrio dentro de la cámara.
Asegúrese de que la interfaz de la cámara de vidrio es estanca y confirme que el resbalón de la cubierta está al alcance del objetivo del microscopio. A continuación, corte 20 por 20 milímetros cuadrados de malla fina y gruesa y utilice piezas de 45 a 50 micrómetros de cinta adhesiva gruesa para crear dos paredes espaciadora en un pedazo de malla fina. Sumerja la malla gruesa y un peso en una placa Petri de 35 milímetros de solución de imagen, y coloque la malla fina bajo un microscopio diseccionado.
Gire la malla fina con las paredes espaciadoras al revés y los espaciadores mirando hacia arriba. Y utilice una pipeta p20 para transferir varios islotes entre los dos espaciadores. Usando los fórceps de los relojeros, coloque la malla boca abajo dentro de la cámara de imágenes del microscopio invertido de modo que los espaciadores miren hacia abajo para sentarse directamente en el resbalón de la cubierta de la cámara, atrapando los islotes entre los espaciadores y la malla en el centro del resbalón de la cubierta.
Tenga cuidado de que la malla esté bien hidratada sin contener volúmenes excesivos de solución que provocarían el movimiento lateral de la muestra. A continuación, coloque la malla gruesa y el peso en la parte superior de la malla fina en la cámara, y agregue la solución de imágenes a la cámara. Una vez inmovilizados los islotes, seleccione el modo de imagen y el objetivo en el microscopio invertido y coloque la cámara con los islotes en la etapa de temperatura controlada del microscopio.
Después de ajustar la perfusión, coloque la entrada por debajo de la salida dentro de la cámara y establezca el flujo de salida en mayor que el flujo de entrada. Asegúrese de que la salida tenga un contacto mínimo con la solución para que elimine la solución en múltiples gotas pequeñas secuenciales, evitando largos intervalos de eliminación continua de la solución. A continuación, inicie la perfusión con una solución de imágenes que contenga tres niveles de glucosa milimétricas y seleccione la ruta de la luz y los filtros para la toma de imágenes de fluoróforos verdes.
A continuación, ejecute imágenes en vivo para configurar los parámetros de imagen y ajuste la vista para capturar los islotes de interés. Para optimizar la relación señal-ruido de la imagen, ajuste la intensidad de la luz de excitación, el tiempo de exposición y el binning, asegurándose de que los ajustes permitan una visualización distinta de cada celda dentro de los islotes con la intensidad y exposición mínima posibles de la luz. A continuación, imagine los islotes en 0,1 a cinco hercios, comprobando la calidad de los datos adquiridos a medida que se capturan.
Cuando la actividad de la célula alfa es detectable, utilice un gráfico en línea de la dinámica de la señal dentro del software de adquisición como sea posible y agregue adrenalina o glutamato en la solución de baño durante dos a cinco minutos. Se observará un salto rápido en calcio seguido de una desaceleración o cancelación de las oscilaciones de las células alfa. A continuación, agregue ghrelina, que se ha informado recientemente para activar las células delta selectivamente.
Se observará un rápido aumento reversible del calcio en una pequeña subpoblación de células de islotes. Luego agregue 10 mililitros de glucosa. Se observará una respuesta oscilatoria coordinada en la subpoblación de células beta.
Tenga en cuenta también las respuestas de las células que fueron previamente activadas por adrenalina o glutamato y ghrelina. Después de guardar las imágenes, importe los datos en un programa de software de análisis de datos adecuado y normalice los datos de intensidad de fluorescencia sin procesar al valor inicial de la fluorescencia. Si el conjunto de datos de intensidad de fluorescencia de variabilidad de celda a celda sigue siendo sustancial, defina una región de control para el intervalo de tiempo durante el cual se aplicó la solución de control.
Si la región de control tiene una señal clara no oscilatoria, suponga que la intensidad de fluorescencia volvió a la línea base después de cada aplicación de la solución de control. Para corregir los datos de lapso de tiempo para cada celda, divida los datos en segmentos separados por los puntos en los que se agregó la solución de control y aplique una corrección lineal a cada segmento. Si el rango de control tiene oscilaciones claras o hay factores adicionales, utilice un algoritmo de detección de picos.
Para medir la frecuencia de los picos de calcio y la respuesta a la adición de agonistas y antagonistas, divida la grabación en intervalos de tiempo iguales, cuente los picos dentro del intervalo y normalice a la duración del intervalo para calcular el curso de tiempo de la frecuencia parcial. Como alternativa, establezca el umbral y calcule la fracción de meseta para cada uno de los intervalos. La fracción indica el porcentaje de tiempo dentro del intervalo que la celda pasó en el estado excitado.
O calcule el área parcial debajo de la curva para cada uno de los intervalos. A menos que la composición lipídica de la membrana se haya visto afectada, los islotes se cargan bastante bien con tintes tropicales. El vector de adenovirus humano tipo 5 también se dirige con éxito a las células de los islotes.
El picoteo de calcio en las células alfa se puede detectar fácilmente a niveles bajos de glucosa, y hay una alta correlación célula por célula entre la actividad a baja glucosa y la respuesta a la adrenalina y el glutamato. Ghrelin activa algunas células sensibles a la adrenalina a baja glucosa, pero no tiene ningún efecto sobre la dinámica de calcio en la mayoría de las células que se activan por baja glucosa. Cuando se analiza en términos de frecuencia parcial, la adrenalina o las células estimuladas por la ghrelina muestran un aumento sustancial en las condiciones de todo o nada, aunque los cambios generales entre el pico basal y el efecto de adrenalina son sutiles.
Por el contrario, el área parcial debajo de la curva es sensible a los cambios introducidos por la adrenalina en todas las células, incluso cuando la actividad basal es alta. Asegúrese de que todas las mallas estén en contacto con la solución de imágenes y tenga cuidado de colocar el tejido razonablemente densamente para evitar burbujas de aire. El método se puede expandir para incluir la inteligencia artificial para diferenciar entre los tipos de celda.
Los marcadores farmacológicos pueden ser reemplazados por la tecnología de reconocimiento de patrones, reduciendo así el tiempo de grabación.
