Se ha establecido que las estructuras de muchas proteínas se estabilizan en enlaces de disulfuro covalente. En trabajos recientes, este bono se ha clasificado como una modificación post-traduccional. Por lo tanto, es importante ser capaz de identificar complejos multimer estabilizados con cisteína en células vivas usando un método que sea rápido y simple.
La principal ventaja de esta técnica es que los resultados se pueden obtener e interpretar de forma rápida, fácil y con un coste mínimo. Para empezar, cultiva células U-2 OS en un plato de seis centímetros cuadrados en Nivel Esencial De Glucosa Media Alta, complementada con 10%FBS y 1%piruvato sódico a 37 grados Celsius en 5%dióxido de carbono. Haga un nuevo stock de 10 iodoacetamida milimétricas justo antes de su uso.
Después de que las células alcancen 50 a 60%confluencia, agregue 0,1 iodoacetamida de concentración final milimolar directamente al medio de cultivo celular. Mece suavemente el plato a temperatura ambiente durante dos minutos. A continuación, aspirar los medios de las células, y lavar las células con cinco mililitros de PBS frío tres veces.
Aspirar la solución final de lavado PBS y añadir un mililitros de PBS frío. Raspa las células de la parte inferior del plato usando un rascador de células. Usando una pipeta de un mililitro, extraiga el PBS y la suspensión celular y dispense todo el líquido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Gire las células a 7.500 veces g en cuatro grados Centígrados durante tres minutos. Aspirar el PBS dejando atrás el gránulo celular. El pellet celular se puede almacenar a menos 80 grados Celsius hasta su procesamiento.
Para extraer la proteína, prepare 100 microlitros de un tampón de lisis 1X diluido en agua doble destilada. Añadir PMSF inmediatamente antes de su uso a una concentración final de un milimolar. A continuación, agregue 50 microlitros del búfer de lisis 1X directamente al pellet celular y vuelva a suspender.
Incubar el extracto sobre hielo durante cinco minutos. Sonicar durante ocho segundos usando el modo de pulso constante en 40%manteniendo el extracto en hielo. Gire el extracto a cuatro grados centígrados y 16.000 veces g durante cinco minutos.
Realice el análisis de Bradford para determinar la concentración de proteínas si se desea. Para preparar la muestra, tome 10 microlitros del extracto de proteína soluble y añada 10 microlitros de un tampón de muestra 1X Laemmli SDS. Mantenga las muestras en hielo.
Caliente la muestra a 85 grados centígrados durante cinco minutos antes de ejecutar el gel. Para comenzar la reticulación de formaldehído, haga crecer las células del sistema operativo U-2 en un matraz de 175 centímetros cuadrados a 70 a 80% de confluencia. En una campana de humo añadir el fijador de formaldehído directamente al medio a una concentración final del 1% e incubar a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 minutos.
Para apagar la reacción añadir 1,25 glicina molar a una concentración final de 0.125 molares e incubar a temperatura ambiente con agitación suave en un balancín durante cinco minutos. Lavar las células con cinco mililitros de PBS frío tres veces. Aspirar la solución final de lavado PBS y añadir 10 mililitros de PBS.
Raspa las células de la parte inferior del matraz usando un rascador de células. Usando una pipeta de 10 mililitros, extraiga el PBS y la suspensión celular y dispense todo el líquido en un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros. Gire las células a 500 veces g y cuatro grados Celsius durante dos minutos.
Aspirar el PBS dejando atrás el gránulo celular. Preparar 10 mililitros del tampón de homogeneización añadiendo 0,25 sacarosas molares, una EDTA milimétrica, 10 HEPES mililolares y 0,5%BSA a pH 7,4. Inmediatamente antes de su uso, agregue PMSF a una concentración final de un milimolar y tres mililitros del tampón de suspensión de núcleos.
Añadir cinco mililitros del buffer de homogeneización directamente al pellet celular y resuspend completamente. Centrifugar la suspensión a 500 veces g y cuatro grados centígrados durante dos minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en cinco mililitros del tampón de homogeneización.
Luego, con un vidrio ajustado Teflon homogeneizador dounce homogeneizar las células a 10 golpes por 500 RPM y centrifugar la suspensión a 1.500 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en un mililitro del tampón de suspensión de núcleos e incubar en hielo durante 10 minutos.
Después de la incubación, centrifugar a 600 veces g durante 10 minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, resuspender el pellet en un mililitro del tampón de suspensión de núcleos y centrifugar de nuevo. El pellet final serán los núcleos aislados.
Extraiga las proteínas como se describe antes de agregar 25 microlitros del tampón de lisis 1X directamente al pellet celular. A continuación, prepare dos muestras para SDS PAGE tomando 10 microlitros cada uno del extracto de proteína soluble y agregue 10 microlitros de tampón de muestra 2X Laemmli SDS y un microlitros de BME. Caliente una muestra a 37 grados centígrados durante cinco minutos y la segunda muestra a 98 grados centígrados durante 15 minutos para invertir el enlace cruzado de formaldehído.
Preparar un litro de 1X Tris-glicina tampón de funcionamiento mezclando 25 tris milimétricos, 192 glicina milimolar y 0.1% de peso por volumen SD. A continuación, configure el aparato de funcionamiento SDS PAGE. Abra el paquete TGX SDS-PAGE 16% prefabricado según el protocolo del fabricante y retire el cassette. Retire el peine que está forrando los pozos y la cinta de la parte inferior del cassette y coloque el gel en el aparato de carrera.
Llene la cámara con el tampón de funcionamiento 1X hasta que los pozos se sumerjan en líquido. Con una pipeta de plástico enjuague los pozos con tampón de funcionamiento. Cargue las muestras en el gel junto con 10 microlitros del marcador estándar pre-stained.
Finalmente, ejecuta el gel a 200 voltios hasta que el frente del tinte esté aproximadamente a un centímetro de la parte inferior del gel. Un análisis de manchas occidentales de extractos celulares totales en ausencia de agente reductor de BME demostró una formación de complejos multiméricos en diferentes poblaciones de células humanas. El complejo desapareció con la adición de BME en las cuatro líneas celulares examinadas, lo que indica la presencia de un enlace de disulfuro.
La confirmación monomérica de dUTPase en células humanas en el momento de la cosecha es una combinación de al menos tres de las isoformas de dUTPase: la isoforma mitocondrial, la isoforma nuclear y una versión truncada observada en M24. La isoforma mitocondrial utilizada como control no formó un enlace de disulfuro y migró al peso molecular previsto para la proteína monomérica. La reticulación de formaldehído de la dUTPasa nuclear demostró la formación de complejos multiméricos.
Cuando el enlace cruzado se invirtió incubando la muestra a 95 grados centígrados durante 15 minutos, el complejo se desestabilizó y se pudo visualizar en su estado monomérico. La adición de iodoacetamida es un paso importante en este procedimiento para bloquear los residuos de cisteína libres y para asegurarse de que los enlaces de disulfuro no son una consecuencia del procedimiento de extracción. Es importante recordar no agregar ningún agente reductor, como BME o DDT a sus muestras SDS-PAGE, ya que estos reducirán los vínculos de disulfuro presentes en la muestra.
