Este protocolo muestra que es posible generar nuevas neuronas directamente en el cerebro a partir de la glia residente y que estas células reprogramadas maduran en neuronas específicas de subtipos. La principal ventaja es el virus AAV dependiente de la cre que permite la focalización específica del NG2-glia y el reportero de GFP que etiqueta las neuronas reprogramadas para su análisis. Generar nuevas neuronas en el cerebro puede conducir a un desarrollo futuro para terapias de reemplazo celular en el cerebro.
En nuestro protocolo generamos las interneuriones parvalbumin-positivas que tienen implicaciones para los trastornos psiquiátricos. La reprogramación in vivo se puede aplicar a otras áreas cerebrales y circuitos dependiendo de qué fenotipo neuronal y condición neurológica desea dirigirse. Demostrando el procedimiento estarán Jenny Johansson: una técnico, Maria Pereira: una ex estudiante de doctorado, y Marcella Birtele: una estudiante de doctorado en nuestro laboratorio.
Para producir vector viral AAV5, sembra las células HEK293T con medio de cultivo estándar en cinco matraces T175. Cuando las células alcancen entre 50 y 70% de confluencia, prepare la siguiente mezcla para la transvección. En un tubo centrífugo de 50 mililitros, agregue cantidades molares iguales de plásmido vectorial y plásmido auxiliar de la serie pDG.
Agregue el búfer Tris-EDTA a un volumen final de 144 microlitros y luego agregue agua ultrapura para dar como resultado un volumen total de 1296 microlitros y mezclar. A continuación, añadir 144 microlitros de cloruro de calcio molar 2,5 y mezclar. Después de eso, añadir 1,92 mililitros de HBS a la solución de ADN y vórtice inmediatamente.
Incubar a temperatura ambiente durante exactamente 60 segundos. Posteriormente, transfiera la solución a 28 mililitros de medio de cultivo celular fresco y mezcle. Sustituya el medio de los matraces por el medio que contiene la mezcla de transvección.
Espere tres días y transfiera los medios a los residuos. Agregue cinco mililitros de tampón de cosecha a cada matraz, luego agregue otros cuatro mililitros de DPBS a cada matraz para enjuagar las células restantes y la piscina con la solución celular. Centrifugar las células cosechadas a 1.000 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y disuelva el pellet en 15 mililitros de tampón de lelisis. Congele el tubo centrífuga de 50 mililitros en hielo seco durante 15 minutos y guárdelo en un congelador de menos 20 grados Centígrados. Antes de su uso, descongelar el izado de la célula cosechada en un baño de agua a 37 grados centígrados.
En este procedimiento, realice la purificación de AAV por ultracentrifugación de gradiente de iodixanol y utilice tubos de techo ultracentrífugo con centrifugación a 350.000 x g durante una hora y 45 minutos a temperatura ambiente. Para extraer la fase que contiene AAV, inserte una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 18 a unos dos milímetros por debajo del borde de la fase 40 a 60% con el bisel hacia arriba y retírese. Asegúrese de detenerse antes de llegar a la banda de proteínas después de que se hayan extraído entre cinco y seis mililitros del vector viral.
Luego, purifica y concentra el gradiente de yodoxanol diluido a través de un filtro de intercambio de aniones, empujándolo a una velocidad no más rápida que una gota por segundo. Posteriormente, empuje tres mililitros de Tampón IE lentamente a través del filtro para lavarlo. A continuación, eluda la mezcla en una unidad de filtro centrífugo con uno o dos mililitros de tampón de elución.
Agregue DPBS al dispositivo a un volumen final de cuatro mililitros. Centrifugar a 2.000 x g a temperatura ambiente hasta que se deje en el filtro menos de 0,5 mililitros de DPBS. Después, retire el líquido de la parte inferior del tubo, rellene con cuatro mililitros de DPBS y centrifugar de nuevo.
Repita este paso dos veces más, asegúrese de que el volumen de vector concentrado en el filtro es de aproximadamente 200 microlitros después de la última centrifugación. Retire el vector concentrado de 200 microlitros con una pipeta y empújelo a través de un filtro de 0,22 micrómetros para esterilizar. A continuación, aliquot 200 microlitros en un vial de vidrio con inserto entrelazado.
Para inyectar factores de reprogramación, coloque un ratón anestesiado en el marco estereotaxico. Administrar la analgesia apropiada al comienzo de la cirugía, luego llevar la punta del capilar de vidrio de la aguja de inyección justo por encima del bregma. Asegúrese de que la punta capilar esté perfectamente recta en los planos A-P y M-L.
Restablezca los valores M-L y A-P a 0,0 en el contador de coordenadas digitales. Para asegurarse de que la cabeza del animal está en una posición perfectamente plana, utilice el contador de coordenadas digitales para medir el valor de la coordenada D-V cuando el brazo A-P está en más 2.0 y menos 2.0, así como cuando el brazo M-L está en más 2.0 y menos 2.0. Ajuste la altura de la barra de dientes y las barras de los oídos en consecuencia.
Después, levante ligeramente la jeringa y perfore un agujero utilizando un taladro dental en las coordenadas de inyección. Comience a perforar en el sitio, trabajando de una manera circular y suave. A continuación, coloque un trozo de gasa de algodón sobre la incisión abierta y enjuague la jeringa con solución salina.
Después del lavado, elaborar una burbuja de aire y luego un microlitro de solución que contenga el vector viral. Asegúrese de que la solución viral se pueda visualizar fácilmente debajo de la burbuja de aire. A continuación, baje la jeringa, progresando lentamente a la profundidad deseada, y asegúrese de que la trayectoria esté libre de fragmentos óseos.
Posteriormente, inyectar un microlitro de la solución viral a una velocidad de 0,4 microlitros por minuto. Cuando se realice la inyección, espere dos minutos para la difusión antes de retirar la jeringa. Después de la difusión, retraiga lentamente la jeringa hasta que la punta del capilar se retire completamente del cerebro, luego sutura cuidadosamente la incisión y retire al animal del marco estereotaxico.
Monitoree al animal en una estación postoperatoria hasta que se recupere la conciencia. Los animales se mantienen hasta 12 semanas después de la inyección por virus para permitir que la glia residente se reprograme en neuronas maduras. Para preparar las rebanadas cerebrales para la electrofisiología usando un vibratome, secise el cerebro desde la parte más rostral hasta el nivel estriado a alta velocidad.
Luego secciona el estriado coronalmente a 275 micrómetros a 0,1 milímetros por segundo. Después de cada sección, retire cuidadosamente el lado estriado no inyectado y transfiera el lado inyectado en un vial con una red inferior y un tobogán de sentido CREB oxigenado en el baño de agua a temperatura ambiente. Mantenga el vial a temperatura ambiente hasta que se corten todas las secciones.
Después, aumente lentamente la temperatura del baño de agua a 37 grados centígrados y déjelo durante 30 minutos, luego apague el calentador y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Después de transferir una sección de tejido a una cámara de grabación para electrofisiología, monte la pipeta de vidrio en el electrodo de grabación y tíquela en la solución. Compruebe dos veces la resistencia del electrodo.
Luego, acérquese lentamente a la celda reprogramada con la pipeta, manteniendo una ligera presión positiva en el electrodo para evitar tapar la punta, y compruebe que la célula es positiva antes de parchear. Cuando la celda esté parcheada, mantenga la celda en la abrazadera de corriente de menos 60 a menos 70 milivoltios, e inyecte 500 corrientes de milisegundos de menos 20 a más 90 picoamperios con incrementos de 10 picoampere para inducir potenciales de acción. Esto es indicativo de una maduración neuronal y una reprogramación exitosa.
Posteriormente, cambie a la abrazadera de voltaje y mida el sodio interno y las corrientes de potasio rectificadoras retardadas en pasos despolarizantes de 10 milivoltios. Aquí hay un post grabado biocytina lleno de neurona reprogramada que muestra morfología neuronal madura y las espinas dendríticas. Aquí, las grabaciones electrofisiológicas de las neuronas reprogramadas muestran la presencia de conexiones funcionales postsinápticas con medidas de actividad espontánea.
Las trazas muestran la actividad inhibitoria que se bloquea con picrotoxina, un antagonista del receptor GABAA y la actividad excitatoria que se bloquea con CNQX, un antagonista del receptor AMPA. Las neuronas parcheadas ya muestran actividad postsináptica a las cinco semanas después de la inyección, y continúan a las ocho y 12 semanas después de la inyección. El número de neuronas con potenciales de acción inducidas actuales también aumenta con el tiempo.
Un análisis más detallado reveló varios patrones de disparo distintos donde la mayoría de las células muestran una actividad de pico rápido similar a las interneurones de parvalbumina. El análisis inmunohistoquímico a las 12 semanas mostró coexpresión del reportero GFP y la parvalbumina. Siguiendo este procedimiento puede examinar la expresión génica con la técnica patch seek o evaluar la conectividad sináptica tridimensional con rastreo monosináptico e iDISCO.
Ahora que es posible reprogramar la glia residente en parvalbumina expresando interneurones, hemos comenzado a investigar si estos son auténticos y se pueden utilizar como una herramienta terapéutica. Recuerde seguir los protocolos y pautas establecidos al manipular animales y usar el virus AAV.
