Este método proporciona una estrategia eficiente para preparar andamios funcionales para la investigación de tumores óseos. Decelularizó la matriz extracelullar ósea, mostró serocompatibilidad variable para la supervivencia y actividades de las células osteosarcomas. La principal ventaja de esta técnica es que el cultivo de células de osteosarcoma en matriz ósea muestra morfología altamente heterogénea similar a una histopatología de osteosarcoma clínico.
El método proporciona un modelo ideal para investigar el desarrollo, la progresión de las sensibilidades de los fármacos de los tumores óseos, como el osteosarcoma, el sarcoma de Ewing y la metástasis de otros tumores malignos hasta los huesos. Para empezar, obtener ratones BALB/c de cuatro a seis semanas de edad, después de eutanasiar un ratón usando tijeras quirúrgicas estériles, cortar el nébulo fresco, la tibia y el fémur de una extremidad posterior. Con la ayuda de pinzas, pelar el tejido epitelial, y luego eliminar la mayor cantidad de tejido blando como sea posible.
Enjuague los huesos de las piernas con una solución estéril de PBS de 10 mM dos veces para extraer sangre en un plato de seis centímetros. Sumerja los huesos en un plato con 75% de etanol durante tres minutos y luego enjuague con PBS dos veces. Almacene los huesos limpios en un tubo centrífugo estéril de 50 mililitros con tubo PBS estéril a 80 grados Centígrados.
Descongelar los huesos congelados a temperatura ambiente y luego congelar de nuevo a 80 grados Celsius durante una hora. Somete los huesos a más de dos ciclos de congelación y descongelación para la lisis celular y la descomposición del tejido. A continuación, coloque los huesos en un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros lleno de 0,5 HCl normales e incubar durante la noche a temperatura ambiente en un agitador orbital con agitación suave para asegurar una cobertura completa e uniforme de los huesos.
Después de la descalcificación, decantar completamente la solución de ácido clorhídrico y enjuagar los huesos con agua corriente durante una hora. Luego, use agua destilada para lavar los huesos dos veces durante 15 minutos por lavado en un agitador orbital. Decantar completamente la solución.
Para extraer los lípidos en huesos desmineralizados, coloque los huesos en un tubo centrífugo de 50 mililitros con una mezcla 1:1 de metanol y cloroformo. Envuelva el tubo con papel de estaño para evitar la luz para la prevención de la descomposición del cloroformo. Y pon el tubo en un agitador orbital durante una hora.
Luego, usa pinzas para transferir los huesos a otro tubo de metanol con papel de estaño durante 30 minutos. Retire el metanol por completo y lave con agua destilada dos veces durante 15 minutos en un agitador orbital. Decantar el agua de lavado final y proceder bajo condición estéril.
Enjuague los huesos en un plato de seis centímetros con PBS estéril durante tres minutos. Añadir 40 mililitros de solución estéril de 0,05%TE en un tubo centrífugo de 50 mililitros e incubar huesos durante 23 horas en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Deseche la solución TE y enjuague dos veces con PBS estéril suplementado con 90 g/ml de ampicilina y 90 g/ml de kanamicina durante 15 minutos cada una en el agitador orbital.
Después de decantar el lavado final por completo, reponer de nuevo con 40 mililitros de PBS estéril con antibióticos. Lávese bien durante 24 horas a temperatura ambiente con un suave temblor para lograr una esterilización eficaz de los espacios porosos. Luego, transfiera los huesos a un tubo centrífugo de 50 mililitros lleno de PBS estéril con antibióticos.
La matriz extracelular ósea preparada se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante dos meses. Sumerja BEM en 75% de etanol en un plato y agite suavemente el plato a mano durante 30 segundos. A continuación, enjuague con PBS durante 30 segundos, dos veces.
Transfiera el BEM a una placa de cultivo celular limpia de seis pozos. Añadir dos mililitros de medio de cultivo completo a cada pozo. Incubar el BEM durante la noche en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados.
Obtener líneas celulares de OS humanos en 100 microlitros de PBS precalejado que contienen el indicador de rojo fenol. Utilice una pipeta para suspender las células del sistema operativo con la concentración aproximada de 1 por 10 a la 5a. Después de que el BEM esté completamente empapado en el medio, desde epífisis proximal o distal, perfore la aguja hasta la cavidad medular de BEM e inyecte las células del sistema operativo en BEM.
Incubar el modelo OS-BEM durante un mínimo de dos horas en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono del 5% a 37 grados celsius para asegurar que las células inyectadas se adhieran firmemente a BEM. Luego, saca el plato de la incubadora. Añadir un medio de cultivo de mililitros en la placa, y mantenerlo en la incubadora durante la noche para recubrir completamente la superficie del cultivo BEM.
Transfiera suavemente el modelo OS-BEM a un nuevo pozo de una placa de seis pozos con una pinza estéril, y realimente un medio de cultivo fresco de un mililitro. Cultivo del modelo durante 14 días en la incubadora. Durante la incubación de 14 días, siga monitoreando el color medio.
Si el medio se convierte en naranja, o incluso amarillo, actualice inmediatamente el medio descartando la mitad del medio antiguo y añadiendo un nuevo medio para mantener un ambiente saludable para las células del sistema operativo. Mantenga el estado de la célula de monitoreo bajo el microscopio de fluorescencia invertido. Cuando las células del sistema operativo se expanden a la placa, transfiera suavemente el modelo OS-BEM a otro nuevo pozo con pinzas estériles.
Después de 14 días de cultivo, enjuague suavemente el modelo OS-BEM con PBS para eliminar el medio de cultivo. A continuación, transfiera a un tubo centrífugo de 15 mililitros y agregue un 10% de formalina tamponada para fijar la identificación histológica. Después de la desmineralización y la descelularización, BEM parece ser translúcido con mayor resistencia y tenacidad en comparación con el hueso nativo del ratón.
Se puede observar claramente un pequeño residuo muscular en el espacio de la cavidad medular. Las imágenes de campo brillante del hueso nativo y el BEM decelularizado, muestran la eliminación a fondo de los núcleos celulares. La estructura porosa natural en la disposición de la red de colágeno está bien mantenida en BEM decelularizado.
Además, la tinción inmunohistoquímica para colágeno I y colágeno IV muestra que los principales componentes de la matriz extracelular se conservan en la tibia del ratón después de la descelularización. Durante el cultivo de 14 días, tanto periosteum como endosteum se infiltran por la expansión de las células del sistema operativo. Las células del sistema operativo en el BEM decelularizado muestran morfología altamente heterogénea similar a las características cicitopatológicas de una sección del sistema operativo.
El análisis inmunohistoquímico después del cultivo en el modelo BEM durante 14 días muestra grandes ventajas en cultivos a largo plazo. Además, las células del sistema operativo y el cultivo de BEM, altamente expresan la glicoproteína de matriz ósea, que es específica para la matriz osteoide. El modelo tridimensional de este in vitro se ha utilizado para demostrar una heterogeneidad fenotípica y un mecanismo regulador de la desdiferenciación del osteosarcoma con éxito.
