Cavefish está criando como un fantástico mural animal para entender la evolución y los procesos biomédicos. Ahora estamos llevando a cabo una investigación biomédica utilizando estos rasgos como un paralelismo de los síntomas humanos. Aquí vamos a mostrar la batería del ensayo de comportamientos y el sistema de análisis que se puede utilizar tanto para estudios evolutivos como biomédicos.
Para ensayar la vibración atrae y el comportamiento, se inserta una varilla de vidrio vibratoria en un recipiente de vidrio que contiene un pez en la oscuridad. Los peces se aclimatan cuatro días antes del ensayo en agua acondicionada con un ciclo oscuro de 12, 12. El día anterior al día del ensayo después de tres días de aclimatación, reemplace el agua en la cámara de ensayo con agua fresca condicionada.
El día del ensayo, los peces se ven privados de alimentos hasta después de que se complete el ensayo, porque el cese cambiará su respuesta a las vibraciones. Prepare el aparato emisor de vibraciones ajustando a 40 Hertz. Establezca los parámetros de grabación adecuados, las condiciones de stock y el archivo de destino.
Coloque el cilindro de ensayo en el escenario de grabación, iluminado con retroiluminación infrarroja en una habitación oscura, y permita que los peces se aclimaten durante tres minutos después de ser colocados en el escenario. Después de la aclimatación de tres minutos en la oscuridad, graba tres minutos y 30 segundos de video. Al inicio de la grabación, inserte la varilla de vidrio vibratoria de 7,5 milímetros de diámetro en la columna de agua, aproximadamente 5 centímetros de profundidad.
Evite hacer ruido o vibraciones mientras coloca la varilla de vidrio vibratoria en el agua, ya que los peces pueden detectar ruidos y vibraciones menores. Asegúrese de finalizar este procedimiento dentro de los 30 segundos posteriores a iniciar la grabación de vídeo para asegurarse de que se graban más de tres minutos de comportamiento. Ejecute el archivo por lotes haciendo doble clic en avs_creator.
murciélago para convertir el vídeo AVI comprimido en formato legible para ImageJ. La macro se puede cargar simplemente arrastrando y soltando en un shell gráfico de la interfaz de usuario. Esta macro habilitará ciertas teclas de acceso rápido para el siguiente análisis.
En el directorio de trabajo, cree una nueva carpeta y asígnela Process_ImageJ. Esta carpeta se utilizará automáticamente para almacenar archivos de salida del siguiente análisis. Haga clic con el botón derecho en el archivo de vídeo AVS que desea analizar y seleccione montaje rápido.
Después de montar el archivo AVS como una unidad externa, abra el archivo AVI en ImageJ. Para establecer la escala de la medida de distancia, seleccione el diámetro de la cámara de ensayo dibujando una línea recta a través de la cámara utilizando la herramienta de selección de línea recta y, a continuación, establezca la escala haciendo clic en analizar, establecer la función de escala. Para nuestro caso, ingresamos 9,4 centímetros.
Marque la casilla de radio del global para estandarizar la escala a través de todo el análisis de video siguiente. Copie el área de la cámara de ensayo utilizando la herramienta de selección ovalada y, a continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione duplicado de imagen. En este momento, especifique el rango de fotogramas que desea conservar para su análisis posterior.
Despeje fuera de la cámara de ensayo y convierta la imagen en una imagen binaria pulsando la tecla de acceso rápido siete en la barra de números. Después de que el fondo se borre, se le pedirá que agregue un punto negro en el centro para indicar la posición de la varilla de vidrio vibratoria utilizando la herramienta de selección ovalada ya establecida en negro con la función de relleno. Haga clic en Aceptar y la macro le pedirá que pase al ajuste de umbral.
Ajuste el umbral para que el pez pueda ser visto a lo largo de todo el clip de vídeo, luego seleccione aplicar. Ejecute el complemento Tracker pulsando la tecla de acceso rápido ocho en la barra de números. Establezca el tamaño mínimo de píxel en 100, cuando se le solicite.
Este proceso generará la distancia entre la varilla de vidrio vibratoria y el pez por fotograma durante los tres minutos del vídeo binario. Para guardar el archivo de seguimiento, pulse la tecla de acceso rápido nueve en la barra de números. Esto exportará automáticamente una pila binaria de imágenes de todo el vídeo y un archivo XLS con coordenadas y datos de distancia, en caso de que sea necesario volver a analizar.
Esto también cerrará todos los archivos asociados con el video actual. Los archivos generados ahora se pueden analizar más en función de la pregunta de investigación específica. Aclimatar cinco peces experimentales durante cuatro días o más en cada cámara de un acuario de grabación de acrílico de 10 litros de diseño personalizado lleno de agua acondicionada.
Cada cámara individual está separada con tablero de acrílico negro. Cada tanque debe estar cubierto para evitar que los peces salten a otra cámara. Ajuste el temporizador de alimentación programable para encender automáticamente la luz LED blanca durante 12 horas y apagar durante 12 horas todos los días durante el período de aclimatación.
Esto ententrará el ritmo circadiano de los peces si el pez es susceptible al entrenamiento. Con el fin de proporcionar una luz blanca más difusa, utilizamos una placa acrílica blanca plana opaca de dimensiones similares al tanque de 10 litros como un difusor para pasar la luz a través de cada tanque. Durante este período, proporcionar una vez al día la alimentación con camarones de salmuera vivos y proporcionar aireación a través de filtro de esponja en cada acuario.
Tenga en cuenta que asegúrese de que los peces se alimentan en tiempo constante. Por ejemplo, una vez al día por la mañana. El día anterior al día del ensayo, tres días o más de la aclimatación, reemplace el agua de la cámara de ensayo por agua fresca acondicionada.
Establezca la grabación de los parámetros en el software VirtualDub. El vídeo se grabará en 15 fotogramas por segundo en el tiempo de exposición fijo. El vídeo se comprime en el códec X264VFW para lograr aproximadamente 700 veces la compresión.
El día de la grabación, alimente a cada pez con camarones de salmuera vivos. Retire todo el filtro de esponja y comience a grabar. Encienda la luz infrarroja en la etapa de grabación.
Al observar la imagen en vivo de VirtualDub en la pantalla, ajuste la posición de cada acuario para asegurarse de que se enfrentan a la cámara USB correctamente. Comience la grabación las 24 horas por la mañana. Por ejemplo, la hora de inicio es 9 a.m.
y la hora de finalización es 9 a.m al día siguiente. Comience a capturar el vídeo y asegure la ubicación para evitar perturbaciones.
De vez en cuando, compruebe si la grabación se está ejecutando. Después de la grabación de 24 horas, asegúrese de que el vídeo se ha guardado correctamente. Transfiera el vídeo a la estación de trabajo del PC para realizar un seguimiento del comportamiento del pez.
Después de transferir el vídeo a la carpeta adecuada, haga rápidamente una comprobación de calidad del vídeo para asegurarse de que es de buena calidad. Esto incluye mirar la iluminación, comprobar si hay un pez en cada sección, y si hay algún movimiento extraño que puede causar un mal seguimiento. Desde aquí, el software gratuito SwisTrack se utiliza para el seguimiento de animales.
La ventaja de este software es que el software puede rastrear múltiples animales a la vez y restar la imagen de fondo mediante el uso de un marco arbitrario que identificamos. Las desventajas son que el seguimiento puede saltar entre arenas que contienen un pez diferente. La imagen de fondo puede no ser adecuada para los fotogramas posteriores, y SwisTrack asigna aleatoriamente ID de seguimiento a peces individuales, por lo tanto, es necesario recuperar la identificación de peces trazando la posición física media de cada pez.
Para superar estos problemas, se utilizan tres enfoques. El uso de máscaras binarias, una para el seguimiento de arenas pares, y otra para el seguimiento de arenas impares. El uso de Win-automation para actualizar automáticamente las imágenes de fondo cada tres minutos y el uso de scripts Perl para reconstruir los IDs de peces.
El primer paso del análisis es hacer las máscaras binarias para arenas pares e impares. Después de comprobar la calidad del vídeo, elija un fotograma representativo en un software de edición de vídeo y utilícelo para crear dos máscaras binarias, una para par y otra para arenas impares. El propósito de estas máscaras binarias es evitar el seguimiento erróneo entre las arenas adyacentes.
Después de crear máscaras binarias, abra los archivos de parámetros SwisTrack que determinan las rutas de acceso y los parámetros del archivo para el proceso de seguimiento. Prepare un archivo de parámetros en cada una de las carpetas de archivos pares e impares para el seguimiento de vídeo. En este archivo, escriba la ruta de acceso a las ubicaciones de archivo de los archivos de vídeo y máscara.
Después de preparar los archivos de parámetros, abra el archivo ejecutable Win-automation que restablece automáticamente el fondo cada tres minutos. Con este archivo ejecutable, SwisTrack se ejecutará automáticamente y, a continuación, abrirá el archivo de parámetros en cada carpeta par o impar de este software de seguimiento. Ejecute el software de seguimiento para realizar un seguimiento del movimiento de los peces.
Dentro de los primeros 9.000 fotogramas de seguimiento, asegúrese de que los peces están siendo rastreados correctamente mirando el componente de seguimiento del vecino más cercano. Después de establecer el seguimiento, vuelva a la pestaña del componente de resta de fondo adaptable y presione la tecla de acceso rápido R en el teclado para ejecutar Win-automation para una resta de fondo adaptable continua. Después de unas cinco horas, se generan archivos de texto para cada pez, que contienen coordenadas X e Y para cada fotograma del vídeo.
Para continuar con el análisis, asigne los tres archivos de script De Perl a la carpeta que incluye carpetas pares e impares. Para convertir la longitud en píxeles a centímetros, es necesario conocer la proporción de centímetro a píxel. Escriba esta proporción en la ubicación adecuada del archivo de script de Perl denominado 1.fillupGaps.pl.
Ejecute 1.fillupGaps. pl Perl script utilizando un emulador de Unix para Windows. En primer lugar, utilice el comando CD para desplazarse al directorio de trabajo actual y, a continuación, escriba Perl 1.fillupGaps.
pl para ejecutar el script Perl. Los otros dos scripts se llamarán automáticamente en orden secuencial. Estos tres scripts asignan cada archivo de seguimiento a cada sección del acuario, y por lo tanto se pueden utilizar para analizar el comportamiento de cada pez.
Consulte con el archivo de texto denominado Summary_Sleep que se genera después de ejecutar los scripts para comprobar dos veces que el número de fotogramas eliminados del análisis es aceptablemente bajo. Falta menos del 15% de las tramas se considera aceptable. Copie y pegue los datos de seguimiento en un archivo de hoja de cálculo con una macro interna.
Esta macro reestructurará los datos analizados en varios niveles de proceso de paso, como el promedio de duración del sueño y la suma de la distancia de natación. Con el fin de manchar la línea lateral de los peces, disolver la solución de caldo DASPEI en agua acondicionada para una concentración final de cinco microgramos por mililitro, luego sumergir el pescado en la solución a temperatura ambiente en un ambiente oscuro durante 45 minutos. Después de 45 minutos, recuperar el pescado de la solución DASPEI y sumergirlo en agua acondicionada con MES triple dos.
Una vez que el pescado está profundamente anestesiado, montar el pescado en un plato de Petri y observarlo bajo un microscopio eficiente. Asegúrese de tomar una serie estadística para incluir todos los planes de los peces en el foco y compilar todo en una sola imagen. Para el análisis de imágenes, agregue una nueva carpeta titulada Process_ImageJ y el archivo de macro a la carpeta que contiene las imágenes que se van a analizar.
Abra el software ImageJ y, a continuación, abra la macro arrastrando el archivo de macro a ImageJ. Ejecute macro haciendo clic en macros, ejecute macro. Si la imagen no se abre automáticamente, haga clic en macro, recogida de archivos.
Macro recogerá automáticamente un archivo de imagen para analizarlo. Para la cuantificación neuromast muestra la región de interés haciendo clic en el polígono dos, y dibuje el área en la imagen. Ocho, cinco a la región duplicada de interés.
Utilice la herramienta de pintura para eliminar o agregar cualquier punto que sea extra o que falte de la imagen anterior y luego ocho, seis. Una vez que aparezcan ocho, seis, dos nuevas ventanas. Una ventana que muestra un esquema de puntos neuromast numerados y una ventana con una tabla con neuromast total cuantificado.
Pulsa siete para guardar ambos archivos. Una vez que haga clic en Aceptar, esos archivos se almacenan y se abrirá un nuevo archivo de imagen para su posterior análisis. Consolidar el recuento de neuromasta mediante la ejecución de macro.
Los siguientes resultados son resultados representativos de lo que se puede esperar para ambos morfos de peces en condiciones controladas. Estas cuatro figuras muestran resultados representativos de los ensayos de comportamiento de atracción de vibraciones. A y B son vistas superiores de la ruta de natación de A, un pez de superficie, y B un pez cueva.
Las líneas rojas son los rastros de las coordenadas generadas por el seguimiento de ImageJ a lo largo de tres minutos de grabación. C y D muestran una comparación de los resultados de C, un pez de superficie, y D, un pez cueva, extraído por la macro de hoja de cálculo de los archivos TXT. El eje Y es el número contado de veces que el pez se acercó a la barra vibratoria.
Cada punto representa una observación experimental durante el ensayo conductual de un pez. Tenga en cuenta que los peces de superficie no muestran un aumento en los enfoques en cualquier frecuencia, mientras que los peces cavernícolas muestran un máximo de atracción alrededor de 35 a 40 hercios. Estas dos figuras muestran resultados representativos de los ensayos de comportamiento del sueño extraídos por las macros de hoja de cálculo de los archivos TXT.
A y B muestran dos de las métricas resumidas automáticamente por el archivo de macro. La Figura A muestra la distancia de natación durante el día y la noche para peces de superficie y peces cavernosos, mientras que B muestra la duración del sueño para ambos morfos. En este caso, el pez cueva mostró hiperactividad y menos sueño en comparación con los peces de superficie.
Estas cifras muestran los resultados del análisis de imágenes DASPEI extraído por la macro de hoja de cálculo de los archivos TXT. A y B demuestran la relación entre el número de neuromast frente al comportamiento de atracción de vibraciones y el tamaño del neuromast frente al comportamiento en peces cavernosos, peces de superficie y progenie de F1. Cada punto representa cada pez.
Tenga en cuenta que el número de neuromasta está correlacionado positivamente con el comportamiento de atracción de vibraciones, lo que sugiere que el neuromast puede regular este comportamiento. El tamaño del neuromast también apoya esta conclusión. C y D son imágenes de ejemplo del neuromast teñido DASPEI de C, un pez superficial, y D, un pez cueva.
Cada punto fluorescente en las imágenes es un neuromasta, que ha tomado DASPEI. Tenga en cuenta, la abundancia notablemente mayor de neuromastos en el pez cueva. Mostramos una serie de análisis de comportamiento para la actividad de natación basada en líneas laterales y el sueño.
El sistema de seguimiento animal también se puede adaptar a otros comportamientos, como comportamientos estereotípicos repetitivos, interacciones sociales y lateralidad conductual.
