Este método permite la generación de un gran número de progenitores de brotes hepáticos humanos y células de tipo hepatocito con alta pureza. La capacidad de generar estas células hepáticas podría ser importante para la medicina regenerativa y otros campos. Mediante el control de las vías de señalización del desarrollo para promover la diferenciación hepática y suprimir la formación de tipos celulares no deseados, este método permite la generación eficiente de progenitores de brotes hepáticos humanos y células hepatocitos por seis y 18 días de diferenciación respectivamente.
La principal ventaja de esta técnica es la alta pureza de las células hepáticas humanas generadas. Para ser este procedimiento, añada 50 mililitros de IMDM a un matraz cónico que contenga una barra de agitación. Calentar el medio a 50 grados Celsius y añadir 0,5 gramos de PVA mientras se agita continuamente para preparar un caldo de PVA a una concentración de 10 miligramos por mililitro.
Después de esto, retire la solución de PVA de la almohadilla de calentamiento y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Una vez que la solución se enfríe, filtre a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros. Prepare el CDM2 y el CDM3 combinando el PVA filtrado con otros reactivos como se describe en la tabla uno del protocolo de texto.
Utilice un filtro estéril de 0,2 micrómetros para filtrar todos los medios. A continuación, prepare el medio base restante, CDM4 y CDM5, como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Para preparar el medio de diferenciación, primero descongelar las moléculas pequeñas congeladas y/o factores de crecimiento a temperatura ambiente.
Aliquotar la cantidad necesaria de medio base y añadir las moléculas pequeñas especificadas y factores de crecimiento al medio base en las concentraciones adecuadas. El día antes de su uso, descongelar la matriz a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, diluir la matriz en una proporción de uno a 100 mediante la adición de 500 microlitros de matriz en 50 mililitros de DMEM frío.
Pipetear la matriz diluida en el número requerido de pozos utilizando el volumen suficiente de solución para cubrir la superficie del pozo. Transfiera la placa recubierta de matriz a una incubadora a 37 grados Centígrados durante al menos 60 minutos. Inmediatamente antes de la siembra, aspirar la solución de matriz restante de los pozos recubiertos.
Luego, aspirar el medio de una placa de cultivo hPSC en gran medida confluente y añadir agente de disociación comprado comercialmente, asegurándose de usar lo suficiente para cubrir la superficie en la que las células están creciendo. Incubar los hPSC en el agente de disociación a 37 grados celsius durante cinco minutos o hasta que algunas colonias comiencen a desprenderse. A continuación, agregue DMEM y F-12 para diluir el agente de disociación.
Utilice una pipeta serológica de cinco mililitros para pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar todas las células de la superficie del pozo. Recoger las células individuales resuspendidas en un tubo cónico de 50 mililitros y diluir con DMEM y F-12 según sea necesario. Centrifugar este tubo de hSC recogidos a 350 veces g y a cuatro grados Celsius durante tres minutos para peletizar las células.
Mientras espera la centrifugación, aspire la matriz de la placa en la que se sembrarán los hPSC. Agregue una cantidad suficiente de medios mTeSR a los pozos receptores para cubrirlos. Cuando la centrifugación esté completa, aspira cuidadosamente el sobrenadante, dejando los hPSC peletados en la parte inferior del tubo cónico.
Resuspender el pellet celular en mTeSR complementado con un micromolar de Tiazovivina obtenido comercialmente. Usando una pipeta P1000, tritura suavemente de dos a tres veces para resuspender uniformemente el pellet celular en una sola suspensión de celda. Pipetear inmediatamente 10 microlitros de la suspensión celular en un hemocitoómetro y contar el número de células.
Ajuste el volumen de los hPSC resuspendidos con mTeSR suplementado con Tiazovivin para lograr la concentración celular deseada para el enchapado. Luego, agitar la placa en un patrón cruzado varias veces para asegurarse de que las células están distribuidas uniformemente. Después de que los hPSC hayan sido chapados durante al menos 24 horas, utilice un microscopio de contraste de fase para comprobar la morfología de las células con énfasis específico en el diámetro de las colonias de hPSC chapadas.
A continuación, prepare el medio de diferenciación APS del día uno como se describe en la tabla dos del protocolo de texto. Un día después de la siembra, aspirar el mTeSR complementado con Thiazovivin de los hPSC chapados y lavarlos brevemente con medios IMDM. Después de esto, agregue el medio del día uno a los hPSC.
Registre el tiempo y vuelva a colocar las células en la incubadora a 37 grados centígrados. Continúe con los pasos de diferenciación subsiguientes preparando el medio de diferenciación necesario y agregándolo a las células en los respectivos días de diferenciación alrededor de la misma hora del día. En este estudio, se generan poblaciones enriquecidas de progenitores de brotes hepáticos y células posteriormente hepatocitos a partir de hPSC.
En el segundo día de diferenciación, las células de rayas primitivas se han diferenciado en el segundo día de células de endodermo definitivas. La gran mayoría de estas células expresan SOX17 y FOXA2. En el tercer día de diferenciación, las células endoderm se han diferenciado en progenitores del foregut que aparecen de forma poligonal.
Más tarde, en el sexto día, los progenitores del foregut se han diferenciado en progenitores de brotes hepáticos. Estos progenitores de cogollos hepáticos expresan AFP, TPX3 y HNF4alpha. A través de tres líneas de hPSC, este método genera seis progenitores hepáticos positivos AFP en una eficiencia de aproximadamente 89%Finalmente, después de 18 días de diferenciación hepática de hPSCs, aparecen células hepatocitos positivas de albúmina.
Morfológicamente, estas células aparecen epiteliales, formando bordes brillantes que recuerdan a la bilis canaliculi. En esta etapa, el citoplasma del día 18 hepatocitos derivados de hPSC parece más oscuro que el núcleo. Al sembrar células madre pluripotentes humanas para la diferenciación, es imperativo sembrarlas en la densidad correcta y también distribuirlas por todo el pozo agitando la placa.
La capacidad de producir hepatocitos humanos in vitro es una tecnología habilitante que permitirá a los científicos investigar los mecanismos subyacentes al desarrollo hepático. Este método produce un gran número de hepatocitos humanos in vitro que podrían utilizarse para investigar la función hepática y la enfermedad y, finalmente, habilitar nuevas terapias para la insuficiencia hepática.
