Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las proteínas fluorescentes, como cómo las proteínas fluorescentes pueden afectar a sus socios de fusión. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una evaluación rápida y fácilmente escalable de los efectos de las proteínas fluorescentes y sus socios de fusión. Aunque este método puede proporcionar información sobre el comportamiento de las proteínas fluorescentes, también se puede aplicar a otras etiquetas codificadas genéticamente.
También demostrará este procedimiento Sonja Di Gregorio, que es estudiante de posgrado en la Universidad Occidental. Cada proteína fluorescente que se prueba mediante este método se clona primero en un vector de expresión de levadura que codifica una versión inducible de gactosa del exón HTT etiquetado con FLAG, uno que alberga la repetición no tóxica 25Q o la repetición tóxica 72Q de la enfermedad de Huntington. Los clones se seleccionan y verifican mediante secuenciación y posteriormente se transforman en levadura.
Para preparar cultivos celulares para los diversos ensayos, raya los clones de levadura que llevan la etiqueta 25Q o 72Q con una proteína de fluorescencia de interés en una placa de agar que contiene medio de selección de levadura con glucosa como fuente de carbono. Al mismo tiempo, la levadura de rayas que lleva levadura 25Q o 72Q optimizó la supercarpeta monomérica GFP para servir como un control positivo. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante dos o tres días.
Seleccione hasta las tres colonias individuales de cada placa e inocular cinco mililitros de medio sintético completo complementado con 2% de glucosa como fuente de carbono. Incubar las culturas a 30 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, transfiera 200 microlitros de cada cultivo nocturno a un tubo de microcentrífuga y centrífuga para peletizar las células.
Lavar al menos tres veces con agua destilada estéril. Es importante lavar bien las células para eliminar todos los rastros de glucosa que podrían contribuir a reprimir la inducción del promotor GAL1. Preparar las células como se demostró anteriormente y volver a suspenderlas en medio sintético completo que contenga 2%gactosa como fuente de carbono para inducir la expresión de fusiones polyQ.
Como control, vuelva a suspender las células en medios que contienen glucosa. Incubar las células a 30 grados centígrados en un rotador de tubo durante la noche. A la mañana siguiente, mida la densidad óptica a 600 nanómetros de cada cultivo utilizando un espectrofotómetro.
Ecualice las densidades celulares a una densidad óptica 600 de 2 en 100 microlitros de medio sintético completo en una placa estéril de 96 pozos. Preparar cuatro diluciones de cinco veces de cada muestra pipeteando 20 microlitros de la muestra desde el pozo anterior hasta 80 microlitros de medios en el siguiente pozo. Utilice una herramienta de fijación de levadura para detectar las células en placas selectivas e incubar a 30 grados centígrados durante dos días.
Iimage las placas con un dispositivo de documentación de imágenes. Prepare los cultivos celulares para este ensayo y luego mida el OD600 de cada cultivo utilizando un espectrofotómetro. Diluir las células a un OD600 de 1 de cada 300 microlitros de medios en la placa de 96 pozos.
Prepare cada muestra por triplicado. Incubar la placa en una incubadora de lector de placas con capacidades de agitación. Establezca el número de muestras, la temperatura a 30 grados centígrados, la absorbancia a 600 nanómetros, la duración de los experimentos a 24 horas y los intervalos de medición a 15 minutos.
Seleccione el modo de agitación continua. Cuando se realice el experimento, cree la curva de crecimiento y cuantifique el área debajo de la curva utilizando software de gráficos científicos. Pegue los datos en una tabla XY con tres valores de réplica.
La curva de crecimiento se mostrará debajo de la carpeta de gráficos en el lado izquierdo. Para cuantificar el área debajo de la curva, seleccione analizar en la parte superior izquierda y haga clic en el área bajo curva en los análisis XY. Comience este procedimiento diluyendo las células preparadas 10 veces en el medio de crecimiento.
Transfiera 200 microlitros de cada muestra a una cámara de imágenes de ocho pozos. I imagen de las células utilizando un microscopio fluorescente de campo ancho estándar. Ajuste la configuración de imágenes para la adquisición de imágenes.
Dado que los agregados 72Q son mucho más brillantes que la señal difusa 25Q, a menudo se requiere utilizar un ajuste de adquisición diferente entre los diferentes plásmidos para evitar la saturación de la señal fluorescente. Procesar las imágenes utilizando un software de procesamiento de imágenes adecuado. En este protocolo, la mancha de puntos se utiliza para examinar los niveles de expresión de proteínas.
Preparar el tampón para generar alsates proteicos añadiendo cuatro micromolares de fluoruro de fenilmetilsulfonil y un cóctel inhibidor de la proteasa al tampón de la lysis. Pellet cinco mililitros de cada cultivo nocturno por centrifugación. Vuelva a suspender las células en 200 microlitros de cuentas de vidrio y 200 microlitros de tampón de lelisis.
Vórtice durante 30 segundos durante 12 rondas, descongelando entre rondas. Centrifugar a 12.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos y recoger el sobrenadante. Utilice un aparato de microfiltración para detectar cantidades iguales de proteína total en una membrana de nitrocelulosa.
Pre-humedezca la membrana con PBS y ensamble el aparato. Conéctelo a una fuente de vacío y asegúrese de que los tornillos estén apretados. Cargue las muestras, encienda el vacío y deje que la muestra filtre a través de la membrana por gravedad.
Blot la membrana en PBS 05%Tween 5%leche libre de grasa durante 30 minutos. Incubar la membrana con anticuerpos primarios anti-bandera a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave la membrana tres veces durante 10 minutos cada una con PBS 05%Tween.
Incubar la membrana con un anticuerpo secundario con etiqueta fluorescente en PBS 05%Tween 5% leche libre de grasa a temperatura ambiente durante una hora. Lave la membrana tres veces durante 10 minutos cada una con PBS 05%Tween. Posteriormente, imagine la membrana utilizando un sistema de documentación de amino blot.
La levadura que expresa 25Q o 72Q HTT exón uno fusionado a la supercarpeta monomérica optimizada con levadura GFP o levadura optimizada etiqueta monomérica BFP2 se culta en medios de glucosa o gata durante la noche y se comprobó en placas de agar o se incuba más en medios líquidos. Mientras que la levadura 72Q optimizado supercarpeta monomérica GFP induce un defecto de crecimiento significativo. La etiqueta monomérica optimizada por levadura 72Q BFP2 muestra un fenotipo de crecimiento similar a las contrapartes 25Q no tóxicas que indican que la naturaleza de la etiqueta fluorescente puede impedir el comportamiento de expansión de poliQ en las células.
La evaluación de la agregación de las fusiones poliQ fluorescentes mediante microscopía fluorescente muestra que la supercarpeta monomérica optimizada con levadura 72Q GFP muestra una agregación significativa, mientras que la etiqueta monomérica optimizada con levadura 72Q BFP2 muestra una señal citoplasmática difusa similar a las contrapartes 25Q no tóxicas. Dado que los niveles de expresión de las diversas fusiones poliQ podrían afectar a la toxicidad, se realizaron manchas de puntos para evaluar los niveles de proteínas. Se muestran los resultados de las diluciones cinco veces de los lysates celulares.
No olvide que esta técnica permite una comparación rápida de proteínas no caracterizadas y fluorescentes con las variantes GFP, pero no puede evaluar directamente la oligomerización. Después de este procedimiento, se pueden realizar otras medidas, por ejemplo, el ensayo de úlceras en células de mamíferos para responder preguntas adicionales como el estado monomérico de las proteínas fluorescentes.
