Este método puede responder preguntas clave sobre la genética de los receptores de células NK, como la diversidad del haplototipo y cómo esto se relaciona con la enfermedad. La demostración visual de este método ayudará a establecer el protocolo en su laboratorio, incluido el proceso de automatización y el análisis de datos. Las principales ventajas de esta técnica son que, a diferencia de los métodos convencionales, qKAT, que significa escritura automatizada KIR cuantitativa, es de alto rendimiento y proporciona el número de copia genética.
qKAT puede proporcionar información sobre la asociación de enfermedades. Las implicaciones de esta técnica pueden ser útiles para la terapia para infecciones virales como el VIH y la hepatitis C, en el cáncer, en el trasplante de células madre y los trastornos del embarazo. qKAT también se puede aplicar en el estudio de la genética de la población, así como explorar la expresión y las interacciones funcionales entre las moléculas kir y HLA.
qKAT consta de 10 reacciones multiplex que se dirigen específicamente a exones de los dos genes KIR y un gen de referencia. En este protocolo, las imprimaciones específicas están diseñadas para detectar los alelos del gen dado y los resultados de la PCR en amplicons cortos. Después de esto, las sondas de hidrólisis específicas de doble etiqueta se utilizan para monitorear la amplificación de PCR en tiempo real.
El análisis de números de copia utiliza la cuantificación relativa de los genes KIR objetivo a un gen de referencia. qKAT está diseñado y configurado para ser una técnica de alto rendimiento. Por lo tanto, cada reacción se puede realizar en poco menos de 1.000 muestras.
Los siguientes pasos muestran los pasos involucrados en la preparación y chapado de cada placa de ADN de 96 pozos. Para empezar, después de cuantificar el ADN, diluir el ADN en una placa de pozo profundo de 96 pozos. Incluya al menos un ejemplo de control con un número de copia conocido y un control que no sea de plantilla.
Centrifugar la placa a 450 gs durante dos minutos. A continuación, dispensar cada muestra en cuadrúplica en placas qPCR de 384 pozos. Después de esto, seque al aire el ADN en un área limpia a temperatura ambiente durante 24 horas.
Para configurar una reacción qKAT para 10 placas de 384 pozos, primero, descongele el búfer qPCR, la imprimación y las alícuotas de sonda a cuatro grados centígrados. Prepare la mezcla maestra sobre hielo de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, utilice una pipeta multicanal para distribuir la mezcla maestra uniformemente a través de una placa de pozo profundo de 96 pozos.
Dispensar 9,5 microlitros de la mezcla maestra en cada pozo de la placa con las muestras de gDNA secas. Después de esto, selle la placa con papel de aluminio e inmediatamente guárdela a cuatro grados centígrados. Recuerde realizar un lavado corto de agua para limpiar las agujas del sistema de manipulación de líquidos si dispensa la mezcla maestra en más de una placa de ADN de 384 pozos.
Centrifugar la placa con las muestras de gDNA a 450 gs durante tres minutos. Luego, incuba la placa a 4 grados celsius para resuspender el ADN y disipar cualquier burbuja de aire. Después de incubar la placa durante la noche, repita la centrifugación para disipar cualquier burbuja de aire.
A continuación, coloque la placa en el muelle de almacenamiento refrigerado. Conecte la máquina qPCR a un controlador de microplacas. A continuación, programe el controlador de microplacas de acuerdo con el protocolo de texto.
Una vez completada la carrera, pida al robot que recoja la placa de la máquina qPCR y colóquela en el muelle de descarte. Después de completar la amplificación, abra el software qPCR. En la pestaña Navegador, abra el archivo de experimento de reacción guardado para una placa.
A continuación, abra la ventana Crear nuevo análisis y seleccione la configuración adecuada para el 2do método Derivative Max. A continuación, seleccione Filter Comb y asegúrese de que los datos recopilados para STAT6 están seleccionados. Seleccione la compensación de color adecuada.
Haga clic en Calcular y, a continuación, haga clic en Guardar archivo. Para analizar los datos con el método Puntos de ajuste, abra la ventana Crear nuevo análisis y seleccione la configuración adecuada para el método Puntos de ajuste. A continuación, seleccione los filtros y las compensaciones de color correctos para STAT6.
Establezca la banda de ruido para excluir el ruido de fondo. Después de esto, abra la pestaña Análisis y establezca los puntos de ajuste en tres y seleccione Mostrar puntos de ajuste. Guarde los cambios y repita los pasos con la configuración adecuada para el análisis de punto de ajuste y 2o derivado para los genes KIR.
Abra la pestaña Navegador en el software qPCR y seleccione Exportación por lotes de resultados. A continuación, abra la carpeta que contiene los archivos del experimento y transfiéralos al lado derecho de la ventana. Haga clic en Siguiente y seleccione el nombre y la ubicación del archivo de exportación.
Después de esto, seleccione el tipo de análisis de interés y haga clic en Siguiente. Asegúrese de que el nombre del archivo, la carpeta de exportación y el tipo de análisis son correctos antes de hacer clic en Siguiente para iniciar el proceso de exportación. Cuando el estado de exportación cambia a Aceptar, la pantalla se moverá automáticamente al siguiente paso.
Asegúrese de que todos los archivos seleccionados se han exportado correctamente y haga clic en Listo. A continuación, utilice los scripts en el protocolo de texto para dividir las placas exportadas en reacciones individuales y para convertir los archivos en un software legible por software de análisis de números de copia. A continuación, abra el software de análisis de números de copia y seleccione Importar archivo de resultados de PCR en tiempo real para cargar los archivos de texto creados por los scripts.
Por último, seleccione Analizar y realice el análisis seleccionando Número de copia de muestra más frecuente. En este protocolo, se utilizó la escritura semiautomática, o qKAT, para copiar genes KIR de tipo numérico. El número de copia más frecuente para KIR2DL4 era de dos copias, mientras que el número de copia más frecuente para KIR3DS1 era cero.
Al intentar este procedimiento, es extremadamente importante asegurarse de que el ADN se cuantifica con precisión, para llevar a cabo todos los pasos sobre el hielo, y para asegurarse de que los reactivos están cubiertos de luz. También es importante realizar controles exhaustivos de los datos sin procesar de las muestras que no se ajustan a las reglas de LD conocidas para los genes KIR. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación para responder preguntas adicionales, por ejemplo, la presencia de genes de fusión, o la identificación de nuevos alelos.
Después de su desarrollo, este método allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunogenética exploraran el papel de la KIR en la biología celular NK, la resistencia a las enfermedades y la reproducción humana.
