La diferenciación de las células progenitoras cardíacas, o CPC, tras la amplificación requiere un cambio de fase de una etapa de proliferación a una etapa comprometida, y este protocolo utiliza un linaje endotelial eficiente en las CPC. Una de las principales ventajas de la técnica es que es aplicable a las CPC aisladas en base a varias técnicas y de diferentes especies. Este protocolo se puede utilizar para mejorar los potenciales terapéuticos de las CPC para la terapia celular.
También se puede utilizar para investigar los potenciales y mecanismos de diferenciación y cómo estos se ven afectados por la enfermedad cardíaca. Las CPC son una población inhomogénea de células que pueden diferir en forma, tamaño y potencia. Por lo tanto, el protocolo debe ajustarse de acuerdo con la subpoblación específica de los CPC utilizados.
Después de anestesiar al ratón, limpie su pecho con 70% de etanol. Usando tijeras, corte la piel y la pared torácica para exponer la cavidad torácica. Use fórceps para levantar el corazón, y luego use tijeras para cortarlo en la base.
Transfiera el corazón a un plato de cultivo P60 que contenga cinco mililitros de PBS frío, y luego use fórceps para bombear el corazón y expulsar la sangre de las cavidades. Coloque el corazón en un plato P60 que contenga cinco mililitros de PBS frío y lávelo. Usa tijeras pequeñas para quitar las aurículas, corta el corazón en dos trozos longitudinales y lávalos en cinco mililitros de PBS helado.
Usando tijeras pequeñas, corta las piezas del corazón en secciones más pequeñas. Añade una gota de la solución de sal equilibrada de Hank que contenga colagenasa B a una concentración de un miligramo por mililitro, y usa una cuchilla de afeitar estéril para picar bien las pequeñas piezas del corazón. A continuación, añadir 2,5 mililitros de la solución de colagenasa B al plato.
Coloque el plato en un ángulo de 30 grados en una incubadora a 37 grados centígrados. Dejar incubar las piezas del corazón picadas durante un máximo de 30 minutos mientras se pasan repetidamente a través de una pipeta Pasteur cada 10 minutos durante la incubación. En primer lugar, añadir cinco mililitros de HBSS frío complementado con 2%FBS a las piezas del corazón picadas y homogeneizadas.
Con un filtro de 100 micrómetros, filtre las piezas del corazón para eliminar cualquier tejido no digerido. Centrifugar a 470 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tóniculo de glóbulos rojos.
Incubar sobre hielo durante cinco minutos con temblores ocasionales. Después de esto, agregue 10 mililitros de PBS y filtre la muestra a través de un filtro de 40 micrómetros para excluir las células más grandes, incluidos los cardiomiocitos residuales. Centrifugar a 470 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos sin rotura.
Luego, re-suspende las células en DMEM complementadas con 10%FBS, con el objetivo de una concentración celular final de un millón de células por mililitro. Distribuya las células en dos tubos para la tinción y clasificación, añadiendo 1,5 mililitros de la solución celular a un tubo y 3,5 mililitros al segundo tubo. Añadir la solución de Hoechst e incubar a 37 grados Centígrados durante 90 minutos con volteo ocasional para asegurar la distribución equitativa del tinte y evitar la coagulación de las células.
La población lateral aparece en la esquina inferior izquierda de Hoechst, aparte de la población principal. En la gráfica FACS se puede identificar en función del control negativo en el que el verapamilo provoca la desaparición de la población lateral. Calienta el medio a 37 grados centígrados y enfría la centrífuga a cuatro grados centígrados.
Centrifugar los tubos de clasificación a 470 veces G y a cuatro grados centígrados durante seis minutos. Luego, vuelva a suspender las celdas en el medio uno. Transfiera las células a un plato P60 permeable al gas que contenga cuatro mililitros de uno mediano.
Cambie el medio cada tres días hasta que las células hayan alcanzado una confluencia entre 70 y 80%S-CPC de cultivo durante dos o tres días en matraces T75 utilizando ocho mililitros de uno medio en cada matraz. A continuación, aspirar cuidadosamente el medio y enjuagar suavemente el matraz con cinco mililitros de HBSS caliente. Tratar las células con cinco mililitros de trippsina EDTA durante cinco minutos a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Luego, agregue cinco mililitros de uno mediano para detener la actividad de la trippsina, y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 470 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender las celdas en uno o dos medios medios.
Plato de las células en platos P60, chapando 250, 000 SP-CPC por plato con tres mililitros de medio que contienen diferentes concentraciones séricas. Después de dos días de cultivo, recoger el medio de cada plato en un tubo de 15 mililitros para recoger las células muertas. Pruebe las células adherentes como se describió anteriormente y recoja la suspensión celular en el tubo de 15 mililitros que contiene el medio recogido.
Centrifugar a 840 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego aspirar el sobrenadante y añadir un mililitro de uno o medio dos para el conteo celular. Manchar los SP-CPC con tríptica azul y contar las células viables y muertas. Primero, aspirar el medio de las células preparadas y enjuáguelas suavemente con cinco mililitros de HBSS caliente.
Tratar las células con cinco mililitros de trippsina EDTA durante cinco minutos en la incubadora celular. A continuación, agregue cinco mililitros de uno mediano para detener la actividad de la trippsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 470 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Aspirar el sobrenadante y añadir dos medios para el conteo celular. A continuación, sembrar 80.000 células en cada pozo de una placa de cultivo pre-recubierta de seis pozos con tres mililitros de dos medianos. Mantenga la placa a 37 grados centígrados durante 20 a 24 horas, y luego cambie el medio en cada pozo a tres mililitros de tres medianos.
Cultivo de la placa durante 21 días, cambiando el medio cada tres días. Después de esto, manchar las células con un marcador endotelial y realizar microscopía de fluorescencia para verificar la naturaleza endotelial de las células diferenciadas. Primero, aspirar el medio de las células preparadas y enjuáguelas suavemente con cinco mililitros de HBSS caliente.
Tratar las células con dos mililitros de trippsina EDTA durante cinco minutos en la incubadora celular, luego añadir tres mililitros de tres medianos para detener la actividad de la trippsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 470 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y añadir un mililitro de tres medianos, pipeteando suavemente para mezclar.
Cuente las células y las semillas entre 2.000 y 4.000 células en 100 microlitros de tres medianos a cada matriz recubierta bien de una placa de 96 pozos. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 16 horas. Después de esto, utilice un microscopio de campo brillante a dos veces más ampliación para tomar una foto de las células.
En este estudio, se exploran condiciones adecuadas para facilitar el compromiso de linaje endotelial de las células progenitoras cardíacas. Cuando la confluencia celular es igual o inferior al 60%, no se observa ninguna diferencia significativa en las muestras tratadas con 3,5%FBS. Cuando las células de esta confluencia se tratan con 0,1%FBS, muestran una disminución en la proliferación celular en la laminin en comparación con la fibronectina, pero no muestran aumento en la muerte celular.
Por el contrario, las células con una alta confluencia no muestran ninguna diferencia significativa en la proliferación celular o la muerte celular entre las dos condiciones. Los cambios en la forma celular parecen ser un indicador de las condiciones adecuadas de cultivo en las que la diferenciación endotelial va a tener éxito. Dentro de siete a 14 días en el medio de diferenciación endotelial, se considera que los cultivos exitosos contienen células más grandes con diferente morfología.
Curiosamente, estas células desaparecieron hacia el final de la fase de diferenciación y tendieron a aparecer en números más bajos y en momentos posteriores en cultivos de alta densidad. La formación de tubos es consistentemente exitosa en células chapadas a baja densidad y diferenciadas en laminin, mientras que se considera que falla principalmente en células chapadas a alta densidad. Mientras que la formación de tubos es mayormente infructuosa en células cultivadas en fibronectina independientemente de la densidad celular, las diferenciadas a baja densidad a veces forman tubos rudimentarios.
La concentración sérica y la densidad celular para inducir el linaje endotelial son cruciales, y deben ajustarse para garantizar la ralentización de la proliferación manteniendo la viabilidad. Tras la inducción del linaje, las CPC de los seres humanos o los modelos de enfermedades preclínicos se pueden utilizar para estudios de trasplante celular para evaluar su potencial de diferenciación in vivo. Este protocolo podría ayudar a estudiar o establecer nuevas herramientas de regeneración cardíaca, y anteriormente se utilizó para estudiar el mecanismo molecular del compromiso de linaje temprano.
