Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo neuromuscular, como el papel de la señalización de calcio en el músculo o las células Schwann en respuesta a la estimulación nerviosa. La principal ventaja de esta técnica es que se puede imaginar la activación de tipos celulares específicos en respuesta a la estimulación nerviosa. Para empezar, obtener ratones transgénicos, y genotipo como se detalla en el protocolo de texto.
Después de la eutanasia, sección transversal a través de todo el animal justo debajo del hígado y justo por encima del corazón y los pulmones con tijeras iridectomía. Disecciona el hígado, el corazón y los pulmones. Tener cuidado de mantener una longitud del nervio frénico que es lo suficientemente largo como para ser arrastrado a un electrodo de succión.
Retire aún más la caja torácica y la columna vertebral, excepto por la cresta delgada alrededor del diafragma. Coloque el diafragma y la muestra del nervio frénico en un tubo de microfure con la solución Krebs-Ringer que contenga un microgramo por mililitro de bungarotoxina alfa con etiqueta fluorescente. Deje que el espécimen se incubar en la solución durante 10 minutos en la oscuridad.
El uso de pasadores minutien inmovilizan el diafragma clasificándolo en un plato de seis centímetros recubierto con gel dieléctrico de silicona y lleno de aproximadamente ocho mililitros de solución oxigenada Krebs-Ringer. Coloque el plato en la etapa del microscopio. Luego, perfunda el diafragma con más solución Krebs-Ringer a ocho mililitros por minuto durante 30 minutos.
A cuatro veces el aumento, usando un micromanipulador, mueva el electrodo de succión sobre el nervio frénico izquierdo. Aplique la succión tirando del barril de una jeringa de cinco mililitros conectada al tubo que está unido al electrodo de aspiración. Asegúrese de que el diafragma se contraiga en respuesta a la estimulación de un hercio examinándolo visualmente con iluminación Brightfield.
Si no es así, ajuste la tensión girando la perilla de voltaje de forma incremental para lograr un pulso supramaximal que se puede verificar mediante el examen visual de la contracción muscular. Si aún no es visible, sople el nervio con la jeringa e intente extraerlo de nuevo aplicando succión. Ahora, apague la perfusión para agregar el inhibidor de la miosina específico del músculo BHC o el antagonista del canal de sodio cerrado por voltaje mu-conotoxina.
Preparar la pre-dilución BHC pipeteando cuatro microlitros de 200 mililitros de BHC en DMSO en un mililitro de solución Krebs-Ringer. Retire un mililitro de solución Krebs-Ringer del plato. A continuación, agregue el BHC pre-diluido al plato.
Después de 30 minutos, encienda la perfusión de la solución fresca de Krebs-Ringer durante otros 20 a 30 minutos. Usando guantes, prepare el electrodo de grabación colocando un vidrio filamentado de borosilicato con un diámetro exterior de un milímetro y un diámetro interior de 0,4 milímetros en un tirador de micropipeta. Apriete las esferas para sujetarlo en su posición y cierre la puerta del tirador.
A continuación, programe el puller como se describe en el protocolo de texto. Para diafragmas embrionarios, mida la resistencia utilizando controles de software del amplificador. Asegúrese de que la resistencia es de cerca de 60 megamios y para diafragmas más antiguos, 10 a 20 megamios.
Ahora, cargue el electrodo de grabación con tres cloruros de potasio molar. A 10 veces el aumento, baje el electrodo en el músculo usando un segundo micromaniprógrafo en el lado opuesto de la etapa como un electrodo estimulante. El uso de software de adquisición de datos electrofisiológicos espere hasta que el potencial de la membrana en reposo cambie de cero a menos 65 milivoltios o inferior.
Estimular en un hercio y verificar la presencia de un potencial de acción muscular mediante la comprobación de un gran potencial que exhibe un modesto exceso. No confunda el artefacto de estimulación con un potencial de acción. A 20 veces la ampliación ubica la banda de la placa final en el centro del músculo buscando conexiones neuromusculares alfa bungarotoxina etiquetadas fluorescentemente bajo excitación de luz amarilla verde.
Cambie a la excitación de luz azul para probar las respuestas de calcio en el músculo, la neurona motora o las células Schwann. En este ejemplo GCaMP tres se expresa en células musculares. Si lo desea, configure el divisor de imagen con filtros de paso de banda y un filtro de borde único dicroico para la imagen de longitud de onda dual.
Realizar experimentos con la barra de brillo en la barra de la tabla de búsqueda establecida en 110%del nivel en el que el indicador de calcio genéticamente codificado que expresa el tejido exhibe saturación a 20 veces el aumento sin binning en respuesta al cloruro de potasio. Graba a 20 fotogramas por segundo para no perderte ningún evento rápido. Estimule con uno a 45 segundos de 20 a 40 hercios de estimulación nerviosa mediante la entrega de un tren de impulsos utilizando un electrodo de succión y recoger respuestas dinámicas de calcio fluorescente en un subestro de celda junto con la señal de unión neuromuscular alfa bungarotoxina estática etiquetada fluorescentemente.
Los agonistas farmacológicos también se pueden añadir mediante la aplicación del baño o por perfusión y las respuestas dinámicas de calcio fluorescente se pueden recoger de la misma manera. Cuando las imágenes o experimentos electrofisiológicos hayan terminado porque se han logrado los resultados deseados, perfunda el agua a través de las líneas de perfusión y succiona el agua dos o tres veces a través del electrodo de aspiración para garantizar que las sales no se acumulen. Un mapa espacial de las respuestas de calcio celular de las células de Schwann a la estimulación del nervio frénico de un diafragma GCaMP tres ratón Wnt en el día siete posterior al parto muestra una restricción a las células Schwann parasinápticas terminales en la unión neuromuscular.
El mismo diafragma fue visualizado después del etiquetado con bungarotoxina alfa etiquetada fluorescentemente, que se une para permitir los receptores de acetilcolina de la unión neuromuscular. El mismo diafragma también fue imán bajo iluminación Brightfield para guiar un electrodo de grabación a la región postsináptica del músculo por la unión neuromuscular. Aquí se muestra la demarcación espacial de células codificadas por colores o regiones de interés tomadas para el análisis de transitorios de calcio individuales.
El mapa espacial de las respuestas de calcio de las células musculares de un mth 5 GCaMP tres diafragma de ratón en P cuatro a la estimulación del nervio frénico en presencia del inhibidor de la miosina BHC muestra una respuesta en toda la región de todas las células musculares del diafragma. Por el contrario, la estimulación del mismo diafragma en presencia de mu-conotoxina provoca una respuesta de calcio espacialmente restringida en la región medial de todas las células musculares del diafragma que corresponde a la banda de placas finales enriquecida con el clúster de receptores de acetilcolina. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como inmuno-histoquímica o inmunoblotting para responder a preguntas adicionales como, ¿cuál es el perfil molecular de las células identificadas por electrofisiología o imágenes de calcio?
Este método puede proporcionar información sobre las respuestas poblacionales de las células Schwann y las células musculares a la estimulación nerviosa en ratones neonatales normales. También se puede aplicar al estudio de ratones mayores o al estudio de ratones que expresan proteínas asociadas a enfermedades neuromusculares.
