Este protocolo introdujo un método definido libre de células alimentadoras para diferenciar las células madre epiteliales limbares corneales de las células madre pluripotentes humanas. Las células madre epiteliales limbales son responsables de renovar el epitelial corneal en el ojo sano. El daño a estas células conduce a una condición conocida como deficiencia de células madre limbares, y a la pérdida de claridad corneal.
Los métodos de cultivo celular que se muestran aquí permiten la producción eficiente de células madre epiteliales limbales para futuras terapias de reemplazo de células corneales. Para comenzar, pasaje y mantenga el cultivo de células madre pluripotentes humanos libres de alimentador como se describe en el protocolo de texto. Asegúrese de utilizar sólo células madre pluripotentes humanas de alta calidad como material de partida para las diferenciaciones.
Cuando esté listo para inducir la formación del cuerpo embrionario, caliente todos los materiales y reactivos necesarios a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar. Separe las células madre pluripotentes humanas libres de alimentador a la suspensión añadiendo 500 microlitros de trippsina EDTA libre de xen a cada pozo. Una incubación a 37 grados centígrados, con 5%CO2.
Después de tres minutos, retire las células de la incubadora y compruebe la morfología celular para determinar la fase óptima para la eliminación de la tripina. Observe cuidadosamente las células para determinar el momento óptimo para eliminar el EDTA libre de xeno, cuando las células se han redondeado hacia arriba, pero no se han separado por completo. En el momento óptimo, retire el EDTA de trippsina libre de xeno de las células.
Agregue el inhibidor definido de la trippsina y la pipeta suavemente para separar las células. Recoger la suspensión de una sola célula en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Centrifugar a 300 g durante cinco minutos.
Luego, retire el sobrenadante y resuspendir las células en un mililitro de medio de cultivo. Después de contar las células, distribuya de dos a tres millones de células en tres mililitros de medio de inducción basal complementados con cinco micromolares blebbistatina a cada pozo de un accesorio bajo de seis pozos. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados con 5%CO2.
Al día siguiente, compruebe la calidad de los cuerpos embrionados bajo un microscopio. Retire el medio y sustitúyalo por tres mililitros de medio de inducción basal complementados con 10 micromolares SB-505124 y 50 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibra de vidrio básico humano. Continúe incubando a 37 grados centígrados con 5%CO2.
Los dos días siguientes, retirar el medio, y reemplazarlo con tres mililitros de medio de inducción basal, complementado con 25 nanogramos por mililitro de proteína morfogenética ósea cuatro. A continuación, continúe con la incubación utilizando las condiciones anteriores. En el cuarto día, preparar una mezcla de 0,5 microgramos por centímetro cuadrado de Laminin-521, y cinco microgramos por centímetro cuadrado de colágeno placental humano tipo cuatro, diluido en DPBS que contiene calcio dos y magnesio dos iones.
Usando esta mezcla, recubrir los platos de cultivo de tejido de 100 milímetros para la diferenciación de adherentes en el volumen total de recubrimiento de cinco mililitros por plato. Selle las placas y guárdelas a cuatro grados centígrados durante la noche. En el día cinco, caliente todos los materiales y reactivos necesarios a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar.
Después de esto, retire la solución de recubrimiento y agregue 10 mililitros de medio de diferenciación precalentó a cada plato. Usando una pipeta, transfiera los cuerpos embrionados de un solo plato a través de dos a tres platos de cultivo de tejidos. Luego, agita suavemente cada plato de cultivo para distribuir uniformemente los cuerpos embrionados.
Mantener las células en cultivo adherente a 37 grados Celsius con 5%CO2 durante las próximas dos semanas y media a tres semanas, asegurándose de reemplazar el medio con 10 mililitros de medio de diferenciación fresca tres veces por semana. Utilice un microscopio de contraste de fase para comprobar regularmente las células para detectar la aparición de morfología epitelial correcta. Para empezar, precalentar todos los materiales y reactivos necesarios a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar, excepto el medio de criopreservación, que debe ser pre-refrigerado.
A continuación, desprende las células madre epiteliales epiteliales derivadas de células madre pluripotentes humanas a la suspensión de una sola célula añadiendo EDTA de trippsina libre de xeno e incubando a 37 grados Celsius con 5%CO2. Después de cinco minutos, retire las células de la incubadora y compruebe la morfología celular para determinar la fase óptima para la eliminación de la tripina. Observe cuidadosamente las células para determinar el momento óptimo para eliminar la trippsina libre de xen xeno, cuando las células se han redondeado hacia arriba, pero no se han separado por completo.
En el momento óptimo, retire el EDTA libre de xeno y desasocie las células como se describió anteriormente. Después de contar las células, centrifugarlas a 300 g durante cinco minutos. Aspirar el medio y resuspender las células en un medio de criopreservación libre de xeno pre-refrigerado.
Con una pipeta, transfiera la suspensión de una sola célula a criotubos para que cada tubo crioconservador contenga entre 500.000 y un millón de células en un mililitro de medio de criopreservación. Coloque los tubos en un recipiente de congelación. En cinco minutos, transfiéralos a un congelador a 80 grados Celsius negativos para su almacenamiento durante la noche.
Al día siguiente, transfiera los tubos a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Antes de descongelar las células, cubra todos los platos y pozos de platos necesarios con una mezcla de cinco microgramos por centímetro cuadrado de colágeno placentario humano tipo cuatro, y 0,5 microgramos por centímetro cuadrado de LM-521, y precaleje todos los materiales y reactivos necesarios a la temperatura ambiente en la campana de flujo laminar. A continuación, retire la solución de recubrimiento de los platos y pozos de placas y agregue el volumen adecuado de medio de diferenciación precalegado.
Añadir un medio de diferenciación precalentó a un tubo cónico de 15 mililitros. Descongelar las células rápidamente a temperatura ambiente. Una vez descongelado, transfiera inmediatamente la suspensión celular al tubo de centrífuga cónica.
Centrifugar a 300 g durante cinco minutos. Aspirar el medio y resuspender el pellet celular en medio de diferenciación para eliminar cualquier medio de criopreservación. Ina las células en platos precapotados en medio de diferenciación a una densidad de 40.000 a 50.000 células por centímetro cuadrado.
Mantener las células a 37 grados celsius en 5%CO2, reemplazando el medio de diferenciación tres veces por semana. En Laminin-521, las indiferenciadas células madre pluripotentes libres de alimentadores de alta calidad forman primero colonias distintas con bordes afilados, que se funden con monocapas homogéneas tras la confluencia. El cultivo en medio de inducción basal, complementado con cinco blebbistatina micromolar durante 24 horas, normalmente produce una suspensión de cuerpos embrionarios apretados y regulares de varios tamaños, mientras que la morfología del cuerpo embrionario no debe cambiar drásticamente durante la inducción ectodérmica superficial en suspensión, se observa que el crecimiento colonial aparece poco después de que los cuerpos embrionarios estén chapados en el tipo de colágeno cuatro y la matriz combinada Laminin-521 en la combinación.
Dentro de 21 a 25 días de diferenciación, las células forman capas homogéneas confluentes, con morfología poligonal, que es típica de las células epiteliales. Las células pueden ser entonces crio almacenadas para su uso posterior, ya que la viabilidad y la morfología se conservan bien después de la descongelación. En el día 24 de la diferenciación, la gran mayoría de las células expresaron proteína de caja emparejada, PAX6, el regulador clave del desarrollo ocular, así como p63 alfa, el marcador LESC ampliamente reconocido.
Delta Np63 está coexpresado en la mayoría de las células alfa positivas p63, confirmando el fenotipo de células alfa positivas delta Np63 más específico de la córnea. Otros marcadores se expresan en parte, mientras que otros son indetectables en este punto, lo que indica que la diferenciación ha progresado hacia los progenitores epiteliales limbares unipotentes, pero la diferenciación terminal en células epiteliales corneales maduras aún no se ha producido. En promedio, cada célula madre pluripotente humana libre de alimentadores indiferenciado genera 0.7 células para el día 25.
Se puede esperar al menos 65%delta Np63 población de células alfa positivas para el día 24. La criopreservación purifica aún más la población celular. En general, los métodos presentados aquí son relativamente simples, pero hay algunos puntos críticos para el éxito.
La alta calidad del material de partida es esencial, así como técnicas de cultivo celular suave y fluido en general. Este protocolo proporciona medios robustos para producir células madre epiteliales limbales para aplicaciones clínicas, así como para diversos fines de investigación. Además, el método se puede modificar fácilmente para la diferenciación de las células epiteliales del pigmento de la retina.
