Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la heterogeneidad de la población a través de la evaluación morfológica de las células. La microscopía in situ permite estudiar las condiciones del cultivo, los rendimientos del proceso y la calidad del producto. La principal ventaja de esta técnica es una medición in situ, que proporciona datos en tiempo real sin muestreo ni riesgo de contaminación.
La microscopía in situ acoplada al reconocimiento automatizado de imágenes puede proporcionar información adicional sobre las estructuras celulares, la forma y la aglomeración celular más allá del tamaño. También es posible medir las concentraciones celulares. El método ha demostrado ser una herramienta fiable.
Ningún método alternativo proporciona la misma información en tan poco tiempo y bajo esfuerzo para la preparación de muestras. El método se ha adaptado a diversos bioprocesos y microorganismos, hongos filamentosos SEG, microalérgicos y levaduras. La sonda se utiliza junto con un ordenador.
El hardware consta de una sonda de una sola varilla con una cámara CCD de alta resolución. Las celdas que pasan a través de un espacio de medición ajustable son imagen de la cámara. La luz entra en el hueco opuesto a la cámara, lo que significa que la iluminación es por transmisión.
Establezca los parámetros de hardware mediante concentraciones de celda que abarquen el rango esperado. Comience a prepararse para las mediciones fuera de línea. Utilice un medidor de espesor para ajustar la separación de medición.
A continuación, gire la tuerca de tornillo de la sonda para ajustar el espacio de medición a cinco o 10 veces el diámetro máximo esperado de la celda. En el ordenador, abra el software del controlador de sonda. En el software, seleccione la sonda deseada y vaya a las acciones de sección.
A continuación, pulse Conectar. A continuación, vaya a la pestaña Control de sonda y ábralo. Inicie la transmisión de vídeo pulsando el botón de reproducción.
Fije la sonda a un trípode y realice los siguientes pasos para cada medición. Trabaje con la sonda y rocíe etanol en la brecha de medición. Limpie cuidadosamente el polvo o la suciedad con papel óptico.
En el ordenador, utilice la vista en vivo para comprobar que el cristal del sensor está libre de partículas. A continuación, coloque un papel óptico seco en la brecha de medición para enfocar. Gire el tornillo de fijación para mover el enfoque manualmente.
Deje de enfocar cuando se vean claramente las fibras individuales del papel en la brecha de medición. Ahora, llena un tubo con caldo de cultivo. Sumerja el microscopio en el caldo, por lo que la brecha está completamente cubierta con suspensión celular.
Utilice los tornillos de unión para ajustar el enfoque en las celdas. Una vez que se haya realizado este enfoque, no lo vuelva a cambiar durante el experimento. Vuelva al software para el experimento.
Vaya al menú Activación. En el menú Activación, establezca la velocidad de fotogramas. Se recomienda un hercio para mediciones fuera de línea.
A partir de ahí, vaya al campo Frames Per Trigger y establézcalo según sea necesario para obtener buenas estadísticas. Aquí, unos 200. Además, vaya al menú General.
Allí, seleccione el directorio en el que se guardarán las imágenes. Comience la adquisición de imágenes con el botón Iniciar adquisición de desencadenador de imagen. Mueva suavemente el tubo para inducir el flujo en la brecha de medición.
Utilice las imágenes de la primera ejecución del experimento como un conjunto de entrenamiento. Tenga listo el software de código abierto Fiji y suelte las imágenes del experimento en su ventana. Cuando haya terminado, seleccione Analizar, seguido de Herramientas y, a continuación, Administrador de ROI.
A continuación, elija una herramienta de selección. En la imagen, decida una partícula para anotar que esté enfocada. Dibuje un círculo a su alrededor con la herramienta de selección.
Pulse Agregar para agregar la anotación al Administrador de ROI. A continuación, seleccione una herramienta de pincel y elija un tamaño de píxel adecuado. Utilice la herramienta de pincel para refinar la selección.
Continúe marcando todos los objetos de interés de la misma manera en unas 15 imágenes. Guarde los archivos anotados y utilícelos como un conjunto de entrenamiento. Cuando el algoritmo de reconocimiento esté entrenado y listo, utilícelo para visualizar los resultados.
En el Analizador de resultados, vaya a Archivo, seguido de Importar archivo. Allí, seleccione el archivo de resultados deseado. Continúe pulsando el botón Crear gráfico.
Seleccione Gráfico de distribución. Esto mostrará la distribución morfológica de la cultura. Vuelva a Crear gráfico para seleccionar Trazado de sensibilidad.
La información mostrada puede ayudar a determinar cuántas celdas se deben analizar para obtener la precisión deseada. Realice mediciones en línea después de completar mediciones sin conexión. Para mediciones en línea, conecte la sonda directamente a un biorreactor.
Una vez conectado, esterilizar correctamente el conjunto. Seleccione Supervisión en el panel. Hay un botón de reproducción para iniciar la adquisición de imágenes y un botón de parada para finalizarlo.
Pulse el botón de reproducción. En el biorreactor, comenzar la inoculación del cultivo. La cámara capturará el vídeo de las celdas y las identificará automáticamente para su análisis.
El monitoreo proporciona datos en línea de tamaños de células y formas de diferentes morfologías celulares durante toda la fermentación. Los resultados en tiempo real se pueden formatear de varias maneras y también se pueden exportar para su posterior análisis. Esta gráfica de distribuciones acumulativas de diámetro de celda S.Cerevisiae se crea a partir de datos analizados mediante esta técnica.
Demuestra que el reconocimiento automático de celdas es capaz de distinguir las células en ciernes y no en ciernes. La curva sólida es la distribución durante un cultivo a las tres horas. La curva punteada es la distribución del mismo cultivo a las siete horas.
La curva discontinua representa los datos recopilados a las 13 horas. El procedimiento de anotación consume mucho tiempo, pero es la clave para lograr la precisión deseada para la identificación de celda. Con este procedimiento, si los tiempos de medición son más cortos que la dinámica del proceso, la medición en tiempo real se puede utilizar para el control del proceso.
Esta técnica allana el camino para utilizar la medición de la heterogeneidad poblacional como parámetro de proceso para los cultivos microbianos desde los primeros pasos de desarrollo del proceso hasta la escala de producción.
